HPLC-UV-ELSD法同時測定黃芪中黃芪皂苷和黃酮類成分

史鑫波，唐志書*，劉妍如，宋忠興，陳衍斌，蘇 瑞，許 剛，王 升

1陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心；2陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，咸陽 712083；3陜西步長制藥有限公司，西安 710075；4中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，北京 100700

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。黃芪中含有皂苷類、黃酮類、多糖類、微量元素等多種成分[2-6]。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪提取物及其制劑具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)肝腎和抗腫瘤等藥理活性[6,7]。黃芪皂苷對心血管和心臟具有保護(hù)作用[8-10]，黃芪多糖具有抗應(yīng)激、抗氧化、增強免疫功能等的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)[11]。黃芪水溶性黃酮類成分對細(xì)胞免疫功能具有促進(jìn)作用[12,13]。在2015版藥典中以HPLC-ELSD和HPLC-UV分別檢測黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，以評價其質(zhì)量的優(yōu)劣，但藥典中黃芪甲苷含量檢測的樣品制樣方法尤為繁瑣。本研究選擇黃芪中黃芪皂苷和黃酮類成分作為研究對象，使用大孔樹脂制備的供試品溶液，黃芪皂苷和黃酮類成分較高，且制備方法簡便，重復(fù)性好。本實驗所建立的HPLC-UV-ELSD 方法簡便、準(zhǔn)確，可同時測定黃芪7種有效成分含量，為有效控制黃芪的內(nèi)在質(zhì)量提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀，配備2489UV/Vis檢測器和2424 EIS檢測器(沃特世科技有限公司)；空氣壓縮機(GA-10B北京中興正科科技發(fā)展有限公司)；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 材料

黃芪甲苷(批號為20150517，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%)；黃芪皂苷Ⅰ(批號為20160601，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%)；黃芪皂苷Ⅱ(批號為20160327，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%)；黃芪皂苷Ⅲ(批號為20160503，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.00%)均購于寶雞市辰光生物科技有限公司，毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號為111920-201505，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.10%)購于中國食品藥品檢定研究院，毛蕊異黃酮(批號為16120911，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.84%)；刺芒柄花苷(批號為17041101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.50%)均購于中國科學(xué)院成都生物研究所。

實驗用黃芪飲片購自陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心劉世軍高級工程師鑒定為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.的干燥根。實驗用乙腈和甲酸均為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.3%甲酸水，梯度洗脫，洗脫條件為：0～10 min，15%～40%乙腈；10～20 min，40%乙腈；20～30 min，60%～85%乙腈；30～40 min，85%～15%乙腈；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測方式：UV/ELSD串聯(lián)監(jiān)測；UV：檢測波長254 nm；柱溫30 °C；ELSD參數(shù)：增益100，漂移管溫度70 °C，氣壓0.7 Mpa(見圖1)。

2.2 對照品溶液制備

分別稱取黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮適量，精密稱定，加甲醇溶解制成各成分質(zhì)量濃度分別為1.78、0.55 、0.40、1.14、0.40、0.20、0.15 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作儲備溶液。

2.3 供試品溶液制備

2.3.1 大孔樹脂制備供試品溶液

黃芪飲片，在60 °C下干燥3 h，粉碎(過4 號篩)，稱取黃芪粉末約4 g，置索氏提取器中，加入80.0 mL甲醇，冷浸過夜，加熱回流4小時，提取液回收并濃縮至干，將濃縮提取物加水5 mL，微熱溶解，通過D 101大孔樹脂脂柱(內(nèi)徑1.5 cm、長12 cm)，以水50 mL洗脫，棄去水液，再用20%乙醇50 mL 洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用85% 乙醇100 mL 洗脫，收集85%乙醇洗脫液，濃縮至干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液1[14]。

2.3.2 固相萃取制備供試品溶液

取2.3.1項下濃縮提取物加水5 mL，溶解，過固相萃取柱(500 mg/6 mL，先用20 mL 甲醇和5 mL 水預(yù)處理)，以10 mL 水洗滌，棄去水洗液，后用20%乙醇溶液10 mL 洗滌，棄去洗滌液。用85%乙醇40 mL 洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，加甲醇使其溶解并定容至5 mL 量瓶中，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液2[15]。

2.3.3 經(jīng)過堿化(KOH)處理的供試品溶液

稱取黃芪粉末約4 g，置索氏提取器中，加2%的 KOH 80.0 mL 甲醇，加熱回流4小時，提取液回收溶劑并濃縮至干，將濃縮提取物加水5 mL，溶解，通過D101 大孔樹脂柱(內(nèi)徑1.5 cm、長12 cm)，以水50 mL 洗脫，棄去水液，再用20%乙醇50 mL 洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用85% 乙醇100 mL 洗脫，收集85%乙醇洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液3[16]。

圖1 黃芪供試品溶液1-4(A1-A4)和混合黃芪皂苷對照品(B)的HPLC-ELSD色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of Astragali Radix sample 1-4(A1-A4) andsaponins mixed reference substances (B)注：1.黃芪甲苷；2.黃芪皂苷Ⅲ；3.黃芪皂苷Ⅱ；4.黃芪皂苷Ⅰ。Note:1.astragaloside I;2.astragaloside II;3.astragaloside III;4.astragaloside IV.

2.3.4 經(jīng)過堿化(氨水)處理后萃取的供試品溶液

取2.3.1項下濃縮提取物加水5 mL，溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，將正丁醇液蒸干，提取液回收溶劑并濃縮至干，將濃縮提取物加水5 mL，微熱溶解，放至室溫，通過D 101型大孔吸附樹脂柱，以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40 %乙醇30 mL洗脫，棄去，再用70%乙醇80 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液4[1]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察

按2.1項下設(shè)定色譜條件，分別精密吸取2.2項下混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1、5、10、15、20、25、30 μL進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、 刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮以色譜峰峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(μg，X)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ以峰面積積分值(Y)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，分別以對照品進(jìn)樣量(μg，X) 的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表1。

表1 黃芪中7種成分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)

2.4.2 精密度試驗

取供試品溶液1，按2.1項下設(shè)定色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮的峰面積RSD峰面積為1.37%、2.76%、1.07%、0.64%、0.54%、0.81%、2.23%，表明儀器精密度好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液1，按2.1項下設(shè)定色譜條件進(jìn)行測定，記錄各色譜峰峰面積，分別在配制后0、2、4、8、12、24 h，各進(jìn)樣10 μL，結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮的峰面積RSD峰面積為0.98%、1.53%、1.30%、0.77%、5.01%、0.49%、2.21%，表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗

取同一批黃芪粉末6份，按2.3.1項下方法制備供試品溶液，按2.1項下設(shè)定色譜條件進(jìn)行測定，結(jié)果黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅰ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、刺芒柄花苷、毛蕊異黃酮的峰面積RSD峰面積為3.63%、4.82%、1.87%、2.52%、3.68%、4.81%、1.56%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗

分別精密稱取已知有效成分含量的藥材2.0 g，分別加入各對照品適量，按2.3.1項下方法制備供試品溶液6份。按2.1項下設(shè)定色譜條件進(jìn)行測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表 2 所示。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.5 樣品含量測定

按 2.3項下方法制備四種不同的供試品溶液，按2.1項下設(shè)定色譜條件進(jìn)行測定，含量測定結(jié)果見表3。

表3 4種黃芪供試品中7種黃酮和皂苷成分含量測定結(jié)果(mg/g， n=3)

四種供試品種中，皂苷總量從高到低：供試品1>供試品2>供試品3>供試品4。黃酮總量從高到低：供試品1>供試品2>供試品4>供試品3。

2.6 主成分分析

主成分分析(Principal component analysis)是一種有效的降低數(shù)據(jù)維數(shù)的方法，適合于高維光譜數(shù)據(jù)的定量及定性分析[17]。為綜合評價不同處理方法對黃芪有效成分的影響，利用綜合評價法以確定適宜的處理方法[18]，通過SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對對已測定的黃芪皂苷和黃酮類成分進(jìn)行了主成分分析。得到主成分總變量和主成分載荷矩陣(表4、5)，前2個主成分的特征值均大于1，計算得到前2個主成分(PC1和PC2)累積方差貢獻(xiàn)值(96.79%)，能夠較客觀地反映不同處理方法黃芪樣品的內(nèi)在質(zhì)量。PC1主要反映了黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅰ、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮的信息，PC2反映了黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅱ和刺芒柄花苷的信息。

采用2個主成分對黃芪不同處理方法進(jìn)行評價。以各主成分因子得分與方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加，可反映各黃芪供試品各類成分總因子得分值F，其綜合評價函數(shù)為F=0.815 14×F1+0.152 44×F2。按綜合評價函數(shù)計算出不同樣品的綜合得分F(見表6)。由綜合得分可知供試品1得分最高，供試品2次之，與黃酮和皂苷成分含量測定結(jié)果一致。

3 討論

本研究采用4種不同的處理方法對黃芪的有效成分進(jìn)行提取，采用HPLC-UV-ELSD同時測定其中7種成分含量，更能簡便、直觀反映黃芪藥材的質(zhì)量，可為黃芪的多組分同時檢測及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)改善提供新思路和參考數(shù)據(jù)。

由供試品3和供試品4的結(jié)果表明，堿化處理的順序會對黃芪皂苷是有一定影響。首先對藥材進(jìn)行堿化處理，再進(jìn)行分離提取，可使黃芪皂苷之間的相互轉(zhuǎn)化更充分，更徹底。結(jié)合黃芪皂苷的結(jié)構(gòu)可得，黃芪皂苷Ⅰ具有2個乙酰基，黃芪皂苷Ⅱ有1個乙酰基，在遇到堿時黃芪皂苷Ⅰ容易脫落乙酰基而轉(zhuǎn)化成黃芪皂苷Ⅳ(或其它類黃芪皂苷)。黃芪皂苷Ⅲ因不具有乙酰基，所以處理方法對其影響較小。黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，但這種轉(zhuǎn)化受堿性條件和提取條件等影響，難以實現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，不能客觀真實地反映黃芪皂苷的實際含量[19]。綜合含量測定結(jié)果和PCA分析結(jié)果可以得出，未經(jīng)堿化處理的黃芪中黃芪皂苷和黃酮類成分含量更高，大孔樹脂可提高皂苷和黃酮類成分的富集。從四種供試品的UV-ELSD分析譜圖可以得出，經(jīng)處理和提取后，部分相關(guān)色譜峰變化比較明顯，即黃芪的成分發(fā)生了較大的變化，就此類成分的分析將在下一步的實驗中進(jìn)行研究。

表4 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率

表5 旋轉(zhuǎn)變換后的因子載荷矩陣

表6 綜合主成分評價結(jié)果