一株秋茄內生真菌Colletotrichum sp. SCSIO KcB3-2的次級代謝產物研究

戴 昱，林秀萍，龐小艷，羅小衛， Limbadri Salendra，楊 斌，王俊鋒，周雪峰，劉永宏,3*

1中國科學院南海海洋研究所廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301；2中國科學院大學，北京 100049； 3南海生物資源開發與利用協同創新中心，廣州 510275

紅樹林生態系統是一個廣泛分布于熱帶和亞熱帶的，由陸地到海洋過渡的特殊的潮間帶生態系統,是四大海洋高生產力生態系統之一，全世界將近60%～70%的熱帶和亞熱帶海岸線都被紅樹林所覆蓋[1,2]。紅樹林作為一種特殊的植物群落，其獨特的環境孕育了豐富的微生物資源，而無論是種類還是分布范圍，在大西洋西岸，中國的紅樹林都具有代表性[3]。自從Cribb等[1]首次從紅樹根部分離到真菌后，對于紅樹林真菌的研究逐漸成為研究的熱點。目前已分離鑒定的紅樹林真菌超過200種,是海洋真菌的第二大生態群落[2,4]。

中山大學林永成課題組從不同紅樹植物秋茄內生真菌中分離到了一系列新穎結構：內酯類，環肽類，呋喃香豆素類，異色酮類，氧雜蒽醌類，萜類，異黃酮類等化合物[5]。本課題組于2016年從一株秋茄內生真菌葡萄座腔菌屬分離得到2個新的苯類衍生物[6]；2017年從一株秋茄內生真菌擬盤多毛孢屬分離得到10個新的水楊酸衍生物[7]。為了從海洋微生物資源中尋找新穎的活性化合物，本課題組對采自深圳大亞灣紅樹植物秋茄中分離得到的一株內生真菌次級代謝產物進行了研究，分離得到14個化合物 (圖1)，分別為：對羥基苯甲醛 (1)，2-(4-羥苯基)乙醇 (2)，2-(4-羥苯基)乙酸乙酯 (3)，2-羥基-2-(4′-羥基苯基)乙醇 (4)，2-甲氧基-2-(4′-羥基苯基)乙醇 (5)，苯乙二醇 (6)，2-氨基-3-苯基-1-丙醇 (7)，對羥基苯乙酸甲酯 (8)，2-(2-羥基乙基)苯酚 (9)，3-chlorogentisyl alcohol (10)，4-hydroxymellein (11)，diaporthin (12)，環(L-苯丙-L-亮)二肽 (13)，環(D-苯丙-L-異亮)二肽 (14)。

圖1 化合物1～14的結構Fig.1 Structures of compounds 1-14

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

供試菌株是從一株分離于深圳大亞灣紅樹植物秋茄樹枝的內生真菌菌株。將保藏于4 ℃的菌株接種到MB瓊脂固體平面培養基上，置于28 ℃ 培養箱中活化7天。然后接種到MB 種子培養液(麥芽提取物 15 g，海鹽 2.5 g，水 1 L，pH 7.4～7.8) 中，于28 ℃、178 rpm 條件下搖床活化3天，最后接種至大米培養基(大米200 g，海鹽3 g，水200 mL)中，室溫下靜置發酵30天，共發酵 9.6 kg。

1.2 菌株鑒定

首先按照文獻[8]提取真菌菌體總DNA，并分別用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對總DNA中的ITS序列進行PCR擴增并測序。其中，該菌株(accession number KcB3-2)與Colletotrichumgloeosporioidesisolate OMC3(NCBI GenBank accession number JF710554),Colletotrichumkahawaeisolate LS8(NCBI GenBank accession number KM520031)以及ColletotrichumignotumCol1(NCBI GenBank accession number JX515292)的相似度為99%，故鑒定為Colletotrichumsp.SCSIO KcB3-2，菌種保存于中國科學院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態重點實驗室。其ITS序列如下:

CTCTACACCCTTTGTGACATACCTATAACTGTT

GCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGTGACCCTCCCGGC

CTCCCGCCCCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAG

GATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA

GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACG

GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCA

GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA

TTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGTCGGAGGAA

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器有:AV-500 和AV-700 超導核磁共振儀(德國Bruker 公司)、中壓制備色譜儀(Buchi 公司)、Hitachi Primade 高效液相色譜儀(日本日立公司)、ZYJ-S 型超凈工作臺(蘇州凈化設備公司)、旋轉蒸發儀(日本東京理化株式會社，EYELAN-1100V-W 型)等;主要試劑有薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)、分析純化學試劑(廣州化學試劑廠和天津富宇精細化工有限公司)等。

1.4 提取與分離

將固體發酵培養物切成小塊，加入等體積丙酮，充分攪拌，超聲提取15 min，再浸泡過夜。經減壓過濾后，濾液減壓蒸餾至無有機溶劑，水相溶液用乙酸乙酯萃取3遍，蒸干乙酸乙酯相得浸膏；濾渣用乙酸乙酯提取5遍，乙酸乙酯溶液再經減壓濃縮得浸膏，合并兩者得粗浸膏；將其分散到甲醇中，然后用石油醚萃取3次，去除石油醚相得到甲醇相，減壓蒸餾最終得總浸膏73.4 g。浸膏用100～200目硅膠拌樣，經中壓柱色譜(200～300目硅膠)分離 (二氯甲烷/甲醇100∶0～0∶100)梯度洗脫后經TLC分析合并得14個流份。Fr.5經ODS中壓反相柱色譜(甲醇/水 10%∶90%～100%∶0)分離得10個子流份，其中Fr.5-5使用半制備HPLC(甲醇/水 30%∶70%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物1(1.9 mg)；Fr.5-7經半制備HPLC(甲醇/水 33%∶67%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物8(4.7 mg)，11(11.0 mg)；Fr.5-8經半制備HPLC(甲醇/水 38%∶62%)分離得到化合物3(21.9 mg)。Fr.7經ODS中壓反相柱色譜 (甲醇/水 10%∶90%～100%∶0)分離得12個子流份,其中Fr.7-3使用半制備HPLC(甲醇/水 17%∶83%，流速 3.0 mL/min)分離得到化合物2(56.8 mg)、5(13.8 mg)、6(33.2 mg)；Fr.7-4使用半制備HPLC(甲醇/水 24%∶76%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物7(11.8 mg)；Fr.7-4使用半制備HPLC(乙腈/水 25%∶75%，流速 3.0 mL/min)分離得到化合物13(3.5 mg)，14(2.5 mg)。Fr.10經ODS中壓反相柱色譜 (甲醇/水 10%∶90%～100%∶0，流速 2.5 mL/min) 分離得8個子流份,其中Fr.10-3使用半制備HPLC(甲醇/水 33%∶67%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物12(7.6 mg)。Fr.11經ODS中壓反相柱色譜 (甲醇/水 10%∶90%～100%∶0) 分離得14個子流份,其中Fr.11-10使用半制備HPLC(乙腈/水 30%∶70%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物4(3.1 mg)。

2 結構鑒定

化合物1無色油狀物;1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:9.71 (1H,s,H-1),7.76 (2H,d,J=9.1 Hz,H-2′,6′),6.87 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:192.6 (s,C-1),168.1 (s,C-4′),133.6 (d,C-2′,6′),128.9 (s,C-1′),117.6 (d,C-3′,5′)。以上數據與文獻[9]報道基本一致，故鑒定該化合物為對羥基苯甲醛。

化合物2紅棕色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.05 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.75(2H,d,J=9.1 Hz,H-3′,5′),3.72 (2H,t,J=7.0 Hz,H-1),2.75 (2H,t,J=7.0 Hz,H-2);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:156.6 (s,C-4′),131.0 (d,C-2′,6′),130.8 (d,C-3′,5′),116.1 (s,C-1′),64.5 (t,C-2),19.2 (t,C-1)。以上數據與文獻[10]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-(4-羥苯基)乙醇。

化合物3無色油狀物；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.06 (2H,d,J=8.5 Hz,H-4,8),6.74 (2H,d,J=8.5 Hz,H-5,7),4.22 (2H,t,J=7.0 Hz,H-1),2.84 (2H,t,J=7.0 Hz,H-2),2.01 (3H,s,H-10);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:173.0 (s,C-9),157.1 (s,C-6),130.9 (d,C-4,8),129.9 (s,C-3),116.2 (d,C-5,7),66.6 (t,C-1),35.2 (t,C-2),20.8 (q,C-10)。以上數據與文獻[11]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-(4-羥苯基)乙酸乙酯。

化合物4無色無定型粉末；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.26 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2′，6′),6.81 (2H,d,J=9.1 Hz,H-3′,5′),4.61 (1H,m,H-2),3.96 (1H,m,H-1b),3.69 (1H,m,H-1a);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:158.5 (s,C-4′),130.3 (d,C-2′,6′),128.5 (d,C-3′,5′) ,116.2 (s,C-1′),78.6 (d,C-2),73.7 (t,C-1)。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-羥基-2-(4′-羥基苯基)乙醇。

化合物5無色無定型粉末；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.13 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2′，6′),6.78 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),4.17 (1H,m,H-2),3.63 (1H,m,H-1b),3.51 (1H,m,H-1a),3.22 (3H,s,2-OCH3);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:158.4 (s,C-4′),130.8 (s,C-1′),129.3 (d,C-2′,6′),116.2 (d,C-3′,5′),85.9 (d,C-2),67.7 (t,C-1),56.8 (q,2-OCH3)。以上數據與文獻[12,13]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-甲氧基-2-(4′-羥基苯基)乙醇。

化合物6無色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.40 (2H,d,J=7.0 Hz,H-2,6),7.36 (2H,m,H-3,5),7.29 (1H,m,H-4),4.72 (1H,dd,J=5.0,7.5 Hz,H-7),3.64 (2H,m,H-8);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:143.2 (s,C-1),129.2 (d,C-3,5),128.5 (s,C-4),127.4 (d,C-2,6),75.9 (d,C-7),68.7 (t,C-8)。以上數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定該化合物為苯乙二醇。

化合物7棕色油狀物；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.40 (2H,m,H-6,8),7.36 (2H,m,H-5,9),7.21 (1H,t,J=7.0 Hz,H-7),3.86 (1H,quint,J=6.0 Hz,H-2),3.54 (2H,m,H-1),2.87 (2H,m,H-3);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:140.1 (s,C-4),130.4 (d,C-6,8),129.3 (d,C-5,9),127.1 (s,C-7),74.5 (d,C-2),66.6 (t,C-1),41.0 (t,C-3)。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-氨基-3-苯基-1-丙醇。

化合物8黃色油狀物；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.10 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.75 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),3.68 (3H,s,H-9),3.54 (2H,s,H-7 );13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:174.6 (s,C-8),157.6 (s,C-4),131.3 (d,C-2,6),126.3 (s,C-1),116.3 (d,C-3,5),52.4 (q,C-9),40.9 (t,C-7)。以上數據與文獻[16]報道基本一致，故鑒定該化合物為對羥基苯乙酸甲酯。

化合物9黃色油狀物；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.07 (1H,dd,J=1.4,7.7 Hz,H-5),7.03 (1H,td,J=1.4,7.7 Hz,H-3),6.75 (1H,m,H-6),6.74 (1H,m,H-4),3.75 (2H,t,J=7.0 Hz,H-8),2.84 (2H,t,J=7.0 Hz,H-7);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:156.7 (s,C-1)，131.9 (d,C-3),128.5 (d,C-5),126.6 (s,C-2),120.5 (d,C-4),116.1 (C-6),63.2 (t,C-8),35.1 (t,C-7)。以上數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-(2-羥基乙基)苯酚。

化合物10紅色無定型粉末；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:6.74 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6 ),6.69 (2H,d,J=2.5 Hz,H-4),4.63 (2H,s,H-7);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:151.6 (s,C-2),144.3 (s,C-5),131.9 (s,C-3),121.9 (s,C-1),115.5 (d,C-4),114.6 (d,C-6),61.2 (d,C-7)。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定該化合物為3-Chlorogentisyl alcohol。

化合物11無色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.58 (1H,t,J=8.0 Hz,H-6),7.08 (1H,d,J=7.5 Hz,H-5),6.94 (1H,t,J=8.5 Hz,H-7),4.56 (1H,m,H-3),4.55 (1H,m,H-4),1.47 (3H,d,J=6.0 Hz,3-CH3);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:170.2 (s,C-1),162.9 (s,C-8),144.1 (s,C-4a),137.8 (d,C-6),117.8 (d,C-7),117.7 (d,C-5),108.0 (s,C-8a),81.6 (d,C-3),69.5 (d,C-4),18.2 (q,3-CH3)。以上數據與文獻[19]報道基本一致，故鑒定該化合物為4-Hydroxymellein。

化合物12白色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:6.45 (1H,d,J=2.1 Hz,H-7),6.33 (1H,d,J=2.1 Hz,H-4),6.28 (1H,s,H-5),4.19 (1H,m,H-10),3.90 (3H,s,H-12),2.58 (2H,m,H-9),1.57 (3H,d,J=6.3 Hz,H-11);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:168.7 (s,C-1),165.1 (s,C-6),162.6 (s,C-8),156.4 (s,C-3),143.6 (s,C-4a),106.5 (d,C-4),104.8 (d,C-5),101.1 (d,C-7),100.5 (s,C-8a),66.2 (d,C-10),56.2 (q,C-12),43.8 (t,C-9),23.3 (q,C-11)。以上數據與文獻[20]報道基本一致，故鑒定該化合物為Diaporthin。

化合物13黃色無定型粉末；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.33 (2H,m,Phe-H-3′,5′),7.29 (1H,t,J=7.0 Hz,Phe-H-4′),7.22 (2H,d,J=7.0 Hz,Phe-H-2′,6′),4.33 (1H,t,J=4.9 Hz,Phe-H-2),3.69 (1H,m,Leu-H-2),3.32(1H,dd,J=4.2,14.0 Hz,Phe-H-3a),2.98 (1H,m,Phe-H-3b),1.46 (1H,m,Leu-H-4),0.89 (1H,m,Leu-H-3a),0.76 (3H,d,J=6.3 Hz,Leu-H-5),0.71 (3H,d,J=6.3 Hz,Leu-H-6),0.07 (1H,m,H-3b);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:170.6 (s,Leu-C-1),168.9 (s,Phe-C-1),136.7 (s,Phe-C-1′),131.8 (d,Phe-C-2′,6′),129.6 (d,Phe-C-3′,5′),128.5 (d,Phe-C-4′),57.4 (d,Phe-C-2),54.1 (d,Leu-C-2),45.2 (t,Leu-C-3),40.2 (t,Phe-C-3),24.6 (d,Leu-C-4),23.4 (q,Leu-C-5),21.4 (q,Leu-C-6)。以上數據與文獻[21]報道基本一致，故鑒定該化合物為環(L-苯丙-L-亮)二肽。

化合物14無色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (700 MHz,CD3Cl)δ:7.36 (2H,t,J=7.7 Hz,Phe-H-3′,5′),7.30 (1H,t,J=7.7 Hz,Phe-H-4′),7.23 (2H,d,J=7.0 Hz,Phe-H-2′,6′),5.91 (1H,s,Phe-NH),5.79 (1H,s,Ile -NH),4.25 (1H,m,Phe-H-2),3.93 (1H,m,Ile-H-2),3.45 (1H,dd,J=3.5,7.0 Hz,Phe-H-3a),2.92 (1H,dd,J=2.8,7.0 Hz,Phe-H-3a),2.03 (1H,m,Ile-H-3),1.30 (1H,m,Ile-H-4a),1.10 (1H,m,Ile-H-4b),0.99 (3H,d,J=7.0 Hz,Ile-H-6),0.90 (3H,m,Ile-H-5) ;13C NMR (175 MHz,CD3Cl)δ:167.1 (s,Phe-C-1),166.7 (s,Ile-C-1),135.5 (s,Phe-C-1′),129.7 (d,Phe-C-3′,5′),129.3 (d,Phe-C-2′,6′),127.7 (d,Phe-C-4′),60.2 (d,Phe-C-2),56.2 (d,Ile-C-2),40.5 (t,Phe-C-3),38.2 (d,Ile-C-3),23.7 (t,Ile-C-4),15.4 (q,Ile-C-6),11.9 (q,Ile-C-5)。以上數據與文獻[22]報道基本一致，故鑒定該化合物為環(D-苯丙-L-異亮)二肽。

化合物1～14的核磁及其它相關詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載( www.trcw.ac.cn)。

3 結論

此次研究從紅樹植物秋茄內生真菌Colletotrichumsp.SCSIO KcB3-2的次級代謝產物中共分離得到14個次級代謝產物，包括苯環衍生物(1～12)和環二肽類化合物(13～14)，3～14均為首次從紅樹植物秋茄內生真菌中分離得到。文獻報道顯示3-chlorogentisyl alcohol(10)對耐甲氧西林以及多藥耐藥Staphylococcusaureus(MRSA，MDRSA)具有顯著的抗菌活性，其MIC(最低抑菌濃度)為12.5 μM，并且表現了顯著的抗氧化活性(DPPH 自由基清除能力)，其IC50值為7.0 μM[18]。4-hydroxymellein(11)對Cladosporiumcladosporioides，C.sphaerospermum和S.aureus表現了一定的抑菌活性，其MIC值分別為 5.00,10.0,8.0 μg/mL[23,24]。真菌是紅樹林微生物資源多樣性的主要類群，也是海洋天然產物以及新藥研發的重要源泉。本研究豐富了紅樹植物內生真菌化學多樣性，為進一步對紅樹林內生真菌次級代謝產物研究提供了參考。