NR2B與鉤藤堿抑制甲基苯丙胺依賴斑馬魚CPP的關系研究

朱 晨，劉 偉，羅超華，陳志杰，周玉婷，霍楚瑩，李 璟，莫志賢*

1南方醫科大學中醫藥學院；2南方醫科大學中心實驗室，廣州 510515

鉤藤為茜草科常綠木質藤本鉤藤Uncariarhynchophylla(Miq.)Jacks.、大葉鉤藤UncariamacrophyllaWall.、毛鉤藤UncariahirsuteHavil.、華鉤藤Uacariasinensis(Oliv.)Havil.或無柄果鉤藤UacariasessilifructusRoxb.的干燥帶鉤莖枝。味甘性微寒、味甘苦、入心包經，具有清熱平肝，息風定驚的作用。鉤藤堿為鉤藤主要成分活性，具有降血壓、鎮靜、抗驚厥、抗癲癇、抗炎等藥理作用[1]。本團隊前期研究表明，鉤藤堿(60 mg/kg)可以抑制苯丙胺引起的大鼠產生條件性位置偏愛(condition place preference,CPP)并且調節其腦內氨基酸類神經遞質的含量[2]；鉤藤堿(80 mg/kg)具有抑制甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)誘導的小鼠CPP的作用[3]。

NMDA受體主要由兩類亞基組成：NMDA受體1(NR1)和NMDA受體2(NR2)。NR2受體由四個亞單位組成(NR2A-D)。NR2B主要存在于腦部，是決定NR2生理性功能的重要亞基[4]。NMDA受體主要參與了學習與記憶的過程，腦內NR2B-NMDARs激活后，M2環處陽離子通道開放，細胞膜外鈣離子內流，使細胞膜內鈣離子濃度升高，最終引起基因轉錄，蛋白表達和突觸后膜功能改變，從而建立長時程增強，有助于促進學習、記憶和認知功能的形成[5]。靜脈給予孕期大鼠氯胺酮后發現，其子代鼠海馬區內NR2B蛋白表達下降，且子代鼠的學習、空間記憶能力損傷[6]。

斑馬魚是一種常用的模式生物，與人類基因高度同源。斑馬魚神經系統簡單但能夠支配復雜的活動，可用于進行運動、學習、記憶等行為學評價。此外，斑馬魚表現出的學習、睡覺、藥物成癮和神經保護表型均與人類相似[7]。目前國內外常用于藥物成癮研究的實驗動物主要是大、小鼠，但單純的嚙齒類動物模型對藥物依賴研究存在明顯的局限性，特別對當前層出不窮的各種新型毒品，單一物種的動物模型不能全面準確地復制出不同毒品品系的特征和成癮癥狀，而苯丙胺類和氯胺酮類物質，以精神依賴為主要表現，傳統的動物模型無法觀察到這些新型毒品成癮的所有特征和表現。與嚙齒類動物相比，斑馬魚成魚器官與系統的簡單性和復雜性之間具有良好的平衡特點，能更準確地反映藥物對動物行為的影響。斑馬魚體積小，重量輕，用藥量少，能明顯減少實驗用成癮性物質，節約藥物資源；斑馬魚繁殖能力強，周期短，能明顯縮短實驗周期。因此，斑馬魚藥物依賴模型的建立和應用將為毒癮醫學領域的研究增加新的模式生物資源。目前國外對阿片類和可卡因這些傳統毒品的斑馬魚模型的研究報道較多，但對新型毒品的斑馬魚模型報道較少。本文采用課題組前期建立的甲基苯丙胺誘導的斑馬魚CPP模型，探索鉤藤堿對METH誘導的斑馬魚CPP的作用，應用蛋白免疫印跡和免疫組化法檢測NR2B的表達，進一步闡明鉤藤堿對METH依賴斑馬魚CPP的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑

鹽酸甲基苯丙胺，購自國家麻醉品實驗室，批號：1212-9802；鉤藤堿(純度：≥98%)，購自日本MATSUURA YKUGYO 公司；鹽酸氯胺酮注射液(規格：2 mL:0.1 g)，購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；三卡因甲磺酸鹽(MS222)，購自Sigma公司;抗NR2B抗體(AB1557P)，購自Millipore公司；魚用生理鹽水，自配，NaCl濃度為100 mmol/L。

1.1.2 儀器

Noldus EthoVision XT 8.5軟件(荷蘭Noldus公司)；ChemiImager 550凝膠成像儀(美國Alpha Innotech公司)。

1.1.3 實驗動物

斑馬魚(野生型，AB系，10～12個月)，雌雄各半，由南方醫科大學斑馬魚實驗中心提供。養魚系統為北京愛生公司凈水系統(T=28.5～29.5 ℃)；生理鹽水濃度為0.03%～0.04%；pH值為7.2～7.6；光照條件為14 h光照(8∶30 am～10∶30 pm)，10 h黑夜(10∶30 pm～8∶30 am)。

1.2 方法

1.2.1 CPP箱的制作

CPP箱長16 cm，寬9 cm，高9 cm。CPP箱分為兩個等體積的箱體組成，一箱涂成黑色，一箱為透明，兩箱體間由一個透明的活動擋板隔開。

1.2.2 斑馬魚基線測定

實驗前將斑馬魚放入CPP箱中適應性喂養2天。第三天記錄15 min內斑馬魚在黑白箱中的停留時間(以斑馬魚頭部為準)。實驗結果顯示，在自然狀態下，>90%的斑馬魚偏愛黑箱，因此將黑箱選為偏愛箱，白箱選為伴藥箱。斑馬魚篩選要求以其在黑箱中的活動時間≥8 min為合格[8]。

1.2.3 CPP模型復制與給藥

選符合基線測定的斑馬魚50條，隨機分為5組：空白組，模型組(40 mg/kg)，鉤藤堿低劑量組(40 mg/kg)，鉤藤堿高劑量組(80 mg/kg)，氯胺酮組(150 mg/kg)。實驗前記錄15 min內斑馬魚在伴藥箱中的停留時間及運動路線。d1、d3、d5上午8：00腹腔注射甲基苯丙胺(40 mg/kg)，放入伴藥箱中訓練40 min(空白組則給予同體積的生理鹽水)；d2、d4、d6同一時間腹腔注射生理鹽水后放入偏愛箱中訓練40 min。d2～d6晚上8：00腹腔注射相應的藥物，對照組和模型組則注射生理鹽水。末次給藥24 h后，記錄斑馬魚在伴藥箱中的停留時間及運動路線。

1.2.4 免疫組化法檢測斑馬魚腦區NR2B的表達

斑馬魚行為學測定結束后，將斑馬魚冷凍處死，迅速取下斑馬魚頭部，于4%多聚甲醛固定24 h。斑馬魚頭部進行常規脫水，包埋。切片機進行切片，厚度約為5 (m，用防脫載玻片撈起，進行常規脫蠟與水化。按常規免疫組化法進行NR2B免疫組化染色，一抗為NR2B(1∶100)，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶200)，陰性對照則用PBS液代替一抗。結果判定陽性表達為胞膜和(或)胞質內呈現棕黃色顆粒染色，若無棕黃色顆粒則為陰性。

1.2.5 Western blotting法檢測斑馬魚腦區NR2B的表達

斑馬魚行為學測定結束后，顯微鏡下取斑馬魚腦組織。加入RIPA裂解液和PMSF(50∶1)，進行超聲勻漿提取組織蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，參考之前的文獻進行Western blot實驗。一抗為NR2B(1∶1 000)，以β-actin為內標；二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)。用ChemiImager 550凝膠成像儀采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個條帶的積分光密度(IOD)值。

1.2.6 統計學處理

2 結果

2.1 斑馬魚訓練前后在伴藥箱的活動變化

用Noldus EthoVision XT 8.5軟件，分析訓練前后斑馬魚在伴藥箱中的停留時間和運動軌跡，比較訓練前后各組斑馬魚在伴藥箱中活動時間的差值(斑馬魚訓練后在伴藥箱中的活動時間-斑馬魚訓練前在伴藥箱中的活動時間)。由圖1可見，與空白組相比，注射METH 40 mg/kg后，模型組斑馬魚在伴藥箱中停留時間明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿高劑量組(80 mg/kg)斑馬魚在伴藥箱中的停留時間明顯減少(P<0.01)。各組斑馬魚造模前后在CPP箱的運動路線圖見圖2。

圖1 在白箱中的停留時間Fig.1 Time spent in white box 注：1：空白組；2：模型組；3：鉤藤堿低劑量組；4：鉤藤堿高劑量組；5：氯胺酮組。與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。Note:1:Control group;2:Model group;3:Rhynchophylline low-dose (40 mg/kg) group;4:Rhynchophylline high-dose (80 mg/kg)；5:Ketamine group.Compared with control group,**P<0.01; compared with model group, ##P<0.01.

圖2 斑馬魚在CPP箱中的線路圖Fig.2 Road maps of zebrafish in CPP compartment注：A:空白組(造模前)；B：模型組(造模前)；C：鉤藤堿低劑量組(造模前)；D：鉤藤堿高劑量組(造模前)；E：氯胺酮組(造模前)；F：空白組(造模后)；G：模型組(造模后)；H：鉤藤堿低劑量組(造模后)；I：鉤藤堿高劑量組(造模后)；J：氯胺酮組(造模后)。Note:A:Control group before modeling;B:Model group before modeling;C:Rhynchophylline low-dose (40 mg/kg) group before modeling；D:Rhynchophylline high-dose (80 mg/kg) group before modeling;E:Ketamine group before modeling;F:Control group after modeling；G:Model group after modeling;H:Rhynchophylline low-dose (40 mg/kg) group after modeling;I:Rhynchophylline high-dose (80 mg/kg) group after modeling;J:Ketamine group after modeling.

2.2 NR2B蛋白免疫組化結果

采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測定陽性細胞的IOD值，取其平均值作為該組各項指標的相對含量。如圖3所示，與空白組相比，經過CPP訓練后，模型組斑馬魚腦區中NR2B陽性細胞數明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，給予鉤藤堿干預后，斑馬魚腦區NR2B陽性細胞數明顯下降，(P<0.01)。

圖3 各組斑馬魚中腦區NR2B陽性細胞的積分光密度Fig.3 The IOD of NR2B positive cells in area of midbrain of zebrafish in each group )注：1：空白組；2：模型組；3：鉤藤堿(40 mg/kg)組；4：鉤藤堿(80 mg/kg)組；5：氯胺酮組。與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。Note:1:Control group;2:Model group;3:Rhynchophylline low-dose (40 mg/kg) group;4:Rhynchophylline high-dose(80 mg/kg) group；5:Ketamine group.Compared with control group,**P<0.01;compared with model group,##P<0.01.

2.3 NR2B蛋白的Western blot分析結果

如圖4所示，斑馬魚腦內的NR2B表達IOD值存在統計學差異。與空白組相比，模型組斑馬魚腦內的NR2B表達增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿高劑量組(80 mg/kg)斑馬魚腦內的NR2B表達明顯減少(P<0.01)。

圖4 斑馬魚腦內NR2B蛋白的表達Fig.4 The protein expression of NR2B in zebrafish brain 注：1：空白組；2：模型組；3：鉤藤堿低劑量組；4：鉤藤堿高劑量組；5：氯胺酮組。與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。Note：1:Control group;2:Model group;3:Rhynchophylline low-dose (40 mg/kg) group;4:Rhynchophylline high-dose (80 mg/kg) group；5:Ketamine group.Compared with control group,**P<0.01;compared with model group,##P<0.01.

3 結果

METH俗稱“冰毒”，是一種被嚴重濫用的新型毒品，具有成癮性極強，復吸率極高等特點，長期以來一直是一個困擾醫學和公眾健康的棘手問題。CPP實驗人為的將藥物與動物先天非偏愛側關聯，對比動物訓練前后在非偏愛側的停留時間來判斷其依賴程度，是公認的用于研究藥物依賴、精神依賴的模型[9]。

本次實驗結果顯示，與空白組相比，腹腔注射METH(40 mg/kg)后，斑馬魚在伴藥箱中的停留時間明顯增加，表明斑馬魚METH依賴CPP模型構建成功；而在給予鉤藤堿(80 mg/kg)治療后，斑馬魚在伴藥箱中的停留時間明顯減少，表明鉤藤堿可以抑制METH引導的CPP行為。

NMDA受體是中樞神經系統中主要的興奮性氨基酸受體之一。NR2B是其發揮生理作用的重要亞基，具有增強學習和記憶能力的作用，在藥物依賴發生發展過程中起著重要作用[10]。大鼠連續4天腹腔注射METH(10 mg/kg)，大鼠腦內NR2B表達顯著上調[11,12]；減少大鼠腦內NR2B亞基，可阻止嗎啡引導大鼠產生獎賞行為[13]；嗎啡誘導大鼠形成條件性位置偏愛之后，艾芬地爾(NR2B拮抗劑)可以劑量依賴性地拮抗嗎啡誘導的CPP[14]。

本實驗研究發現，與空白組比較，給予METH 40 mg/kg后，METH依賴斑馬魚腦內NR2B陽性細胞數及NR2B蛋白的表達明顯增加；給予鉤藤堿(80 mg/kg)干預后，斑馬魚腦內NR2B陽性細胞數和NR2B蛋白表達明顯減少，表明NR2B與鉤藤堿抑制METH引起的CPP效應有關，是動物行為學改變的神經生物學機制之一。

鉤藤堿是中藥鉤藤的主要活性成分，本團隊前期研究發現，鉤藤堿可以抑制METH誘導小鼠和斑馬魚產生CPP效應，并且抑制其腦內TH蛋白的表達[8]。鉤藤堿能抑制苯丙胺依賴大鼠產生CPP效應，并減少其腦內伏核和杏仁核中NR2B蛋白及NR2BmRNA的表達[15,16]。鉤藤堿可抑制METH引起的大鼠伏隔核內GluR2/3亞基蛋白表達上調，以及下丘腦內GluR2/3亞基蛋白表達下調[17]。鉤藤堿(60 mg/kg)可抑制METH依賴大鼠海馬CA1區和紋狀體中p-CREB、c-Fos陽性細胞數明顯增加的趨勢，使p-CREB及c-Fos陽性細胞數恢復正常[18]。

本研究表明，鉤藤堿(80 mg/kg)具有抑制METH依賴斑馬魚CPP的作用，這種作用可能與降低斑馬魚腦內NR2B蛋白的表達有關。由于藥物成癮的發生與發展極其復雜，關于鉤藤堿調控NR2B的機制仍需進一步深入研究。