走馬胎中大葉紫金牛酚的分離鑒定與生物活性評價

陳錦蘭, 吳浩祥, 胡銳紅, 肖文靜, 袁捷

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走馬胎中大葉紫金牛酚的分離鑒定與生物活性評價

陳錦蘭1, 吳浩祥2*, 胡銳紅3, 肖文靜4, 袁捷4

(1. 廣州中醫藥大學，廣州 510405; 2. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣州 510405; 3. 佛山市氣象局, 廣東 佛山 528000; 4. 廣州中醫藥大學中醫藥數理工程研究院，廣州 510006)

為了解走馬胎()的化學成分，從其乙酸乙酯提取物中分離鑒定出大葉紫金牛酚。體外活性評價結果表明，大葉紫金牛酚具有良好的抗炎、抗腫瘤活性以及一定的神經保護作用。這是首次對大葉紫金牛酚進行系統研究，為綜合開發與利用走馬胎提供科學依據。

紫金?？?；走馬胎；大葉紫金牛酚；生物活性

大葉紫金牛酚[1]是具有順式取代的十七碳直鏈烯烴的間苯二酚衍生物，因大量存在于紫金牛科(Myrsinaceae)植物大葉紫金牛()中，并成為其特征性成分。大葉紫金牛酚結構獨特，母體為苯酚結構，連接長鏈烯烴取代基，致使化合物脂溶性顯著提高；此外苯環結構上帶有易發生氧化反應的酚羥基活潑基團，同時側鏈烯烴基團處于不穩定的順式取代模式。大葉紫金牛酚獨特新穎的結構吸引了藥物化學家們的研究興趣。Guan等[2]對大葉紫金牛酚進行了抗肺結核活性研究，并揭示其具有潛在的抗肺結核活性。然而目前對大葉紫金牛酚的研究還是嚴重不足的，繼續深入研究、開發與評價其新穎生物活性將具有顯著意義。

大葉紫金牛在我國廣東、廣西、江西、云南等地有分布；其干燥根及根莖即為跌打損傷良藥走馬胎。作為嶺南民間常用中藥，走馬胎始載于清代《生草藥性備要》[3]，有祛風除濕、壯筋骨、活血化瘀等功效，主治風濕筋骨疼痛、產后血瘀、癰疽潰瘍等[4]?？梢姡唏R胎具有多方面的生物活性；此外，近年來的現代藥理學研究發現，走馬胎還具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗血栓和抗氧化作用等[5–6]。

鑒于走馬胎多種藥理活性已被證實，現代臨床將之用于痛風性關節炎[7]、類風濕關節炎[8]、骨質增生癥[9]、骨傷骨折[10]等疾病的治療，效果顯著,引起了對走馬胎包括化學成分和藥理學在內全面研究的熱潮。隨著研究的深入，走馬胎多種化學成分被陸續報道，主要包括苯酚類、香豆精類、三萜皂苷類、甾醇類等成分[5]。然而目前國內外學者對走馬胎化學成分的研究，一直側重于三萜皂苷類和巖白菜素類化學成分，未見基于走馬胎臨床藥效對大葉紫金牛酚進行全面和深入的研究。同時，大葉紫金牛酚作為走馬胎的主要活性成分，闡明其藥理活性，將為明確走馬胎的藥效物質基礎，同時合理使用走馬胎提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和耗材

質譜：Waters 3100 SQDMS (低分辨ESI)；核磁共振譜：Bruker Avance III 500型核磁共振儀, 以氘代試劑殘留溶劑峰為內標；液相色譜與質譜聯用儀：Waters 2695 LC偶聯Waters Acquity ELSD、Waters3100 SQDMS，分析色譜柱型號：Waters Sunfire?RP C-18，3.5m, 4.6 mm×100 mm；CO2細胞培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；垂直超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；低速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)；MK3型酶標儀(美國Thermo fisher公司)；超低溫冰箱(日本三洋SANYO公司)；FM-500型倒置熒光生物顯微鏡(上海普丹光學儀器有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；Greiss NO試劑盒(碧云天生物技術研究所)；MTT噻唑蘭(美國Sigma公司)；叔丁基過氧化氫(t-BHP)(成都格雷西亞化學技術有限公司)；200~300、300~400目柱層析硅膠(青島海洋化工廠生產)；HSGF254 TLC預制薄層板(德國Merck公司)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala，Sweden)；CHP20P MCI樹脂(75~150m) (Mitsubishi Chemical Corporation)；96孔細胞培養板(美國CORNING公司)；胎牛血清(FBS) (澳大利亞Gibco公司)；青-鏈霉素(P/S)(Thermo公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；RPMI-1640培養基(德國Biological Industries公司)；DMSO溶液(美國Sigma公司)；HPLC分析用乙腈(Merck公司)；實驗用水由美國Millipore公司純水、超純水系統提供；其他有機溶劑均為國產分析純產品；TLC顯色劑為5%香蘭素乙醇液。

1.2 材料

走馬胎15 kg，2017年12月購于中山市健禾中藥飲片有限公司，標本號No. 20171201。

1.3 細胞株

炎癥細胞株：脂多糖誘導的小鼠單核細胞RAW264.7; 腫瘤細胞株：人非小細胞肺癌A549和人大細胞肺癌NCI-H460; 神經細胞株：人神經母細胞瘤SH-SY5Y。均來自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.4 大葉紫金牛酚的提取和分離

走馬胎(15 kg)，粉碎后用95%工業酒精室溫浸泡3次，每次5 d，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味。將得到的總浸膏用水懸浮，然后用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮萃取液，得到乙酸乙酯部位800 g。將乙酸乙酯部位用MCI柱層析處理，以乙醇-水(50%、70%、95%乙醇)為流動相梯度洗脫，得到3個組分A、B和C。

結合化合物結構特征，首先對組分C (605 g)用硅膠(200~300目)柱層析，正己烷∶乙酸乙酯[10∶1~1∶1,/(下同)]梯度洗脫，薄層(TLC)檢測合并，共獲到6個子組分B1~B6。

組分B2經凝膠柱層析，氯仿∶甲醇(1∶1)洗脫,得到3個子組分B2A~B2C；B2B經硅膠(300~400目)柱層析，正己烷∶乙酸乙酯(10∶1~1∶1)洗脫,最后獲得化合物1 (102 g)，含量約為0.68%。

1.5 結構鑒定

化合物1 棕色油狀物, ESI-MS: 347.28 [M + H]+，1H NMR (500 MHz, CDCl3):H6.18 (1H, s, H-2), 6.24 (1H, s, H-4), 6.24 (1H, s, H-6), 2.35 (2H, t,= 7.2 Hz, H-1′), 1.56 (2H, m, H-2′), 1.27 (2H, over- lapped, H-3′), 1.27 (2H, overlapped, H-4′), 1.27 (2H, overlapped, H-5′), 1.27 (2H, overlapped, H-6′), 2.01 (2H, overlapped, H-7′), 5.35 (1H, overlapped, H-8′), 5.35 (1H, overlapped, H-9′), 2.01 (2H, overlapped, H- 10′), 1.27 (2H, overlapped, H-11′), 1.27 (2H, over- lapped, H-12′), 1.27 (2H, overlapped, H-13′), 1.27 (2H, overlapped, H-14′), 1.27 (2H, overlapped, H-15′), 1.27 (2H, overlapped, H-16′), 0.88 (3H, t,= 6.5 Hz, H- 17′)。以上數據與大葉紫金牛酚(圖1)[11]的一致。

圖1 大葉紫金牛酚結構式

1.6 大葉紫金牛酚的生物活性篩選

體外抗炎活性篩選 采用比色法[11–12]，用NO試劑盒測定小鼠巨噬細胞的NO。將小鼠巨噬細胞RAW264.7以5′105濃度接種于96孔板中，置于37℃，5% CO2細胞培養箱中孵育過夜。然后加入10% FBS、LPS和大葉紫金牛酚，輕輕搖晃96孔板，然后繼續放置于培養箱中培養，18 h后取100L培養基上清液，加入Greiss試劑，室溫放置10 min, 然后以完全培養基加顯色劑作為空白對照，在420 nm下用酶標儀測定各孔的吸光度(OD值)。陽性對照:l-氮甲基精氨酸(l-NMMA)。

體外抗腫瘤活性篩選 采用MTT法[13]，通過測定大葉紫金牛酚對A549和NCI-H460細胞的增殖抑制作用來評價。將MTT溶于磷酸緩沖液(PBS)，配成濃度為5 mg mL–1的MTT溶液備用。取對數生長期腫瘤細胞，以RPMI 1640培養液調整細胞懸液濃度為1′105cfu mL–1，接種于96孔培養板內，每孔加入100L，然后分別加入2、4、8、12和16g mL–1大葉紫金牛酚100L，每個濃度6個復孔，同時設空白對照組(只加培養基)。置于37℃5% CO2培養箱中培養72 h后，每孔加入5 mg mL–1的MTT溶液30L，繼續培養4 h，在160×下離心22 min，棄上清液，每孔加入100L DMSO溶解。酶標儀快速震蕩60 s后，570 nm波長處測定吸光度(OD值)，計算細胞增殖抑制率和IC50。細胞增殖抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD空白對照)×100%。陽性對照：多柔比星。

體外神經保護活性篩選 用MTT法[13]檢測SH-SY5Y細胞的存活率。將SH-SY5Y細胞以6×109L–1的濃度接種于經多聚賴氨酸包被過的培養皿中，加入含有10% FBS和1% P/S的DMEM培養基，置37℃5% CO2培養箱中培養。每天全量換液1次，隔天傳代，并在顯微鏡下進行觀察。將SH- SY5Y細胞以6×105L–1的濃度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，每孔100L。將細胞分為0 (正常組)、50、100和200mol L–1的t-BHP組，每組6個復孔。待細胞融合度達到80%~90%時，吸凈培養基，加入含有相應濃度t-BHP的培養基，置于37℃5% CO2培養箱中分別培養3、6、12和24 h，觀察SH-SY5Y細胞衰老情況。將SH-SY5Y細胞以6×109L–1的密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中,每孔100L。將細胞分為正常組、模型組、給藥組(含有25、50、100和200g mL–1大葉紫金牛酚的模型組)，每組6個復孔。置于37℃5% CO2培養箱中培養24 h，觀察大葉紫金牛酚對SH-SY5Y細胞衰老的保護情況。

2 結果和討論

2.1 大葉紫金牛酚抗炎活性評價

盡管在嶺南民間，走馬胎一直被用于治療類風濕關節炎等多種炎癥類疾病，療效也同時被現代臨床學研究所證實；然而走馬胎治療炎癥類疾病的藥效基礎一直未見報道。本試驗通過大葉紫金牛酚對脂多糖誘導RAW264.7細胞炎癥的抑制作用來評價。結果表明，大葉紫金牛酚具有良好的體外抗炎活性，IC50為17.85mol L–1。因此，大葉紫金牛酚為走馬胎治療炎癥類疾病的藥效基礎之一。

2.2 大葉紫金牛酚抗腫瘤活性評價

現代藥理學研究證實，走馬胎具有抗腫瘤作用[5–6], 并表明三萜皂苷類成分是走馬胎抗腫瘤作用的藥效物質之一。大葉紫金牛酚作為走馬胎中主要化學成分之一，但尚未見報道其是否具有抗腫瘤作用。本試驗通過大葉紫金牛酚對A549和NCI-H460細胞的增殖抑制作用來評價。結果表明，大葉紫金牛酚具有中等抗腫瘤作用，對A549和NCI-H460腫瘤細胞的IC50分別為38.01和12.21mol L–1。

2.3 大葉紫金牛酚神經保護活性評價

細胞衰老是指正常細胞在通路調控下不可逆地進入生長停滯期，在形態學上表現為細胞核膜崩解、細胞膜脆性增加、選擇性通透能力下降、多種細胞器和細胞內結構發生退行性形變等狀態[14–17]。為綜合開發與利用走馬胎，本試驗通過探討大葉紫金牛酚是否可以延緩SH-SY5Y細胞衰老來評價其是否具有神經保護作用[18–19]。結果表明(圖2)，不給藥的模型組對SH-SY5Y細胞存活率有抑制作用，而不同濃度的大葉紫金牛酚則不同程度地對t-BHP的抑制作用有所逆轉。因此，大葉紫金牛酚對SH- SY5Y細胞衰老有保護作用，并且與濃度有依賴關系。

圖2 MTT法測定SH-SY5Y的存活能力

3 結論

本研究對大葉紫金牛酚進行了系統研究，首次報道大葉紫金牛酚的抗炎、抗腫瘤以及神經保護活性。實驗結果顯示，大葉紫金牛酚具有良好的抗炎和抗腫瘤活性，以及具有一定的神經保護活性。明確了大葉紫金牛酚是走馬胎治療炎癥類疾病和抗腫瘤的藥效物質基礎之一，為綜合開發與利用走馬胎提供科學依據。

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Isolation, Identification and Biological Evaluation of Gigantifolinol from

CHEN Jin-lan1, WU Hao-xiang2*, HU Rui-hong3, XIAO Wen-jing4, YUAN Jie4

(1. Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405, China; 2. The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405, China; 3.Foshan Meteorological Bureau,Foshan 528000, Guangdong, China; 4. Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006, China)

In order to understand the chemical constituents of, the gigantifolinol were isolated and identified from EtOAc extract.activity screening, gigantifolinol showed potent anti-inflammatory and anti-tumor activities, and moderate neuroprotection activities. This is the first systematic study of gigantifolinol, which might provide a scientific basis to the development and utilization of.

Myrsinaceae;; Gigantifolinol; Biological activity

10.11926/jtsb.4018

2018-11-13

2018-12-21

廣東省中藥新藥研發重點實驗室開放運行費(2017B030314096)資助

This work was supported by the Open Operation Cost of Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Development and Research of Chinese Medicine (Grant No. 2017B030314096).

陳錦蘭，女，在讀碩士研究生，研究方向為中藥新藥研發。E-mail: mizi04@126.com

E-mail: gzwhx2010@163.com