超高壓處理僵直前兔肉對其斬拌肉糜流變特性及蛋白二級結構的影響

薛思雯，衣曉坤，于小波，徐幸蓮*

1(南京農業大學 食品科學與技術學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京，210095) 2(山東省煙臺市東方海洋科技股份有限公司，山東 煙臺，246003)

超高壓加工(high pressure processing, HPP) 技術作為一種非熱加工技術，在食品加工行業備受青睞[1]。使用該技術，可在較低溫度下實現對于食品的殺菌滅酶作用，因此能更好地保證食品中的營養成分不被破壞[2]。隨著食品行業的發展和消費者對于營養和健康食品需求的提升，超高壓加工技術在食品領域中的應用逐漸從殺菌拓展到改善食品品質等方面[3]。其中，利用超高壓技術來改變或改善肉制品食用品質與功能特性在近年來備受研究者關注。但是伴隨而來的就是超高壓設備的維護問題。超高壓設備依賴高壓腔體的密封性以及高壓閥的工作性能，而當超高壓壓力達到400 MPa及以上時，會顯著增加對設備的損耗，使其使用壽命縮短[4]。因此若能在400 MPa以下壓力水平可以最大程度利用超高壓設備，將在維護設備穩定運行的基礎上，最大限度提高企業的經濟效益。

宰后動物的肌肉在僵直前仍然會進行一系列的代謝活動，且極易受到外界因素變化的影響，導致成熟后肉的品質會發生改變[5]。因此，若對該狀態下的肌肉進行較低水平(100～300 MPa)短時的超高壓處理，將很有可能改變肌肉的宰后代謝過程，從而達到改變肉中蛋白質，尤其是肌原纖維蛋白(約占總蛋白的55%)的理化狀態的目的。除了可能能起到改善凝膠特性的作用之外，這對維護超高壓設備、延長機器壽命也能起到良好的效果[6]。

凝膠類肉制品如香腸、肉丸等方便肉制品深受消費者青睞。該類產品的口感和品質主要由肉中蛋白質，尤其是肌原纖維蛋白的理化和凝膠特性決定[7]。但這類產品多以豬肉、牛肉等為主要原料，并且添加大量NaCl以及脂肪，不符合當下的健康消費觀念[8]。近幾年中國兔肉產量逐年增加，根據數據統計，中國自2012～2016年的兔肉年產量達到784 065 t/年[9]。另外兔肉屬于高蛋白，低脂肪且風味獨特的健康肉類，從健康飲食角度出發，具有較大的開發潛能[10]。若能利用較低的超高壓水平達到改變肉蛋白理化特性的目的，使其能在加工過程中減少脂肪和NaCl的添加量但不降低產品的食用品質，將有效促進多方利益。

因此，本文擬采用100～300 MPa的壓力水平，分別處理僵直前的兔肉15 s或180 s，來研究較低強度下的超高壓處理是否能夠改變蛋白質的凝膠特性，從而為將來進一步開發健康的低鹽低脂的凝膠類兔肉制品提供技術和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3月齡雄性新西蘭大白兔(Oryctolagus cuniculus)，每只重約2.5～3 kg，購于江蘇省農業科學院畜牧所；NaCl為分析純，購于廣東科密歐化學試劑有限公司；聚酰胺/聚乙烯真空包裝袋，20 ℃條件下透氧率為1 cm3/(m2·h)，購于北京華頓塑料有限公司。

1.2 儀器與設備

S-IL-100-850-9-W超高壓設備，英國Stansted Fluid Power公司；LABRAM 800 型激光拉曼光譜儀，法國JY公司；MCR 301 流變儀，奧地利Physica公司；SANYO SIM-F124 制冰機，日本三洋公司；ASC-30 電子秤，沈陽朝陽衡器廠；Grindomix GM 200 刀式混合研磨儀，德國Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

取7只健康的新西蘭雄性大白兔，宰前充分休息，提供飲水，減少應激。頭部機械致昏后，切斷頸部血管放血，迅速剝皮去頭、爪及內臟，自來水沖洗去除血跡，瀝干淋水放入冰箱(4 ℃)，約15 min后，剔取腰大肌。將兔腰大肌切成2 cm × 3 cm的小塊，將所有兔腰大肌混合，分裝到真空包裝袋中(每袋75 g)，該過程在45 min之內完成。然后使用100、200或300 MPa高壓分別處理15 s或180 s，超高壓處理過程在30 min之內完成。高壓處理結束后，將經超高壓處理的以及未經超高壓處理的對照組兔肉置于4 ℃冷庫24 h，待肌肉充分成熟，再進行下一步處理。

1.3.2 肉糜制備

樣品制備參照XUE等[11]的方法。Grindomix GM 200刀式研磨儀的斬拌速率設定為3 000 r/min處理10 s。 然后加入最終體積25%(體積分數)的鹽溶液(0 ℃， 8%(質量分數)NaCl)繼續斬拌(3 200 r/min,30 s)。 得到最終的肉糜體系鹽為2%(質量分數)。斬拌過程中，肉糜溫度始終保持在7 ℃以下。

1.3.3 拉曼光譜測定

取適量肉糜用于激光拉曼光譜掃描實驗。拉曼光譜測定和參數選定參照XU等[12]的方法，測定400～3 600 cm-1的拉曼光譜，測定時分辨率為2 cm-1，曝光時間為60 s，數據獲取速度為120 cm-1/min。每個樣品隨機選擇3個點進行測定。拉曼光譜分析使用NGSLabSpec 5.0軟件，對光譜扣除背底后進行平滑，再以(1 003±0.5) cm波數處的峰強度對拉曼光譜進行歸一化處理，并根據ALIX等[13]的方法，對酰胺Ⅰ帶(1 645 ～1 685 cm-1)進行計算，得到α-螺旋，β-折疊，β-轉角以及無規卷曲的相對含量。

1.3.4 動態流變測定

取適量肉糜用于升溫過程中肉糜流變特性測定。參照YANG等[14]的方法，設置參數為：狹縫寬度1.5 mm， 應變2%，振動頻率0.1 Hz，升溫速率1.5 ℃，升溫20～80 ℃，如式(1)所示。

(1)

式中：Tanδ代表相位用正切值，G″代表損耗模量，G′代表儲能模量。

1.4 數據處理

所有試驗都進行3次重復，每次重復至少進行3次平行試驗。利用SPSS 23.0對所得到的二級結構相對含量進行Duncan多重比較方差分析，當P<0.05 時認為差異顯著。動態流變特性取3次重復的平均值作圖；儲能模量(G′)和相位角正切值(tanδ)的起點和終點平均值與蛋白質二級結構相對含量一起用于主成分分析(Umetric Simca P 11.0+)。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理僵直前兔肉對斬拌兔肉糜中蛋白二級結構的影響

拉曼光譜技術是分析研究蛋白體系微環境以及蛋白結構變化的重要且經典的方法，該方法尤其適合水分活度高的體系[15]。圖1所展示的對照組兔肉糜蛋白拉曼光譜圖，可明顯觀察到蛋白體系的拉曼特征峰，如C—H彎曲振動，S—S伸縮振動等，因此，本次試驗的拉曼光譜分析結果是可信的[16]。

1-100 MPa處理15 s；2-100 MPa處理180 s；3-200 MPa處理15 s；4-200 MPa處理180 s；5-300 MPa處理15 s；6-300 MPa處理180 s；7-對照組圖1 不同處理組兔肉糜拉曼光譜圖(360～3 600 cm-1)Fig.1 Raman spectrum of the untreated rabbit meat batter

由圖2可知，將僵直前兔肉采用超高壓處理會使后期斬拌形成的肉糜體系中的蛋白α-螺旋結構的相對含量顯著降低(P<0.05)。其中，200 MPa-15 s處理組的α-螺旋結構顯著低于其他處理組(P<0.05)。除了100 MPa-15 s處理組外，其他高壓處理組中蛋白體系的β-折疊的相對含量顯著高于對照組(P<0.05)。 說明在這些超高壓條件處理后，蛋白質二級結構發生了解螺旋現象。值得注意的是，當壓力水平達到300 MPa時，肉糜中蛋白質的α-螺旋結構含量有回升的趨勢，且300 MPa-15 s處理組的α-螺旋結構含量顯著高于200 MPa-15 s處理組(P<0.05)。 這一現象很可能是由于超高壓處理保壓過程中，蛋白質結構的變化隨著超高壓處理的程度不同而達到不同的穩定狀態。因此當壓力達到300 MPa時，蛋白質解螺旋的二級結構可能又重新結合形成新的螺旋結構，表現出比200 MPa處理條件下更高的螺旋結構含量。

CON為對照組；100-15為100 MPa處理15 s；200-15為200 MPa處理15 s；300-15為300 MPa處理15 s；100-180為100 MPa處理180 s；200-180為200 MPa處理180 s； 300-180為300 MPa處理180 s圖2 超高壓處理僵直前兔肉對斬拌兔肉糜中肌原纖維蛋白二級結構的影響Fig.2 Effects of pre-rigor high-pressure processing on the secondary structures of proteins of the rabbit meat batters注：圖中相同二級結構結果中不同字母表示結果差異顯著(P<0.05)。

2.2 超高壓處理僵直前兔肉對斬拌兔肉糜動態流變特性的影響

結合圖3和表1發現，經超高壓處理過的蛋白在加熱前儲能模量(G′)顯著高于對照組(P<0.05)。

1-對照組；2-100 MPa處理15 s；3-100 MPa處理180 s；4-200 MPa處理15 s；5-200 MPa處理180 s；6--300 MPa處理15 s；7-300 MPa處理180 s圖3 超高壓處理僵直前兔肉對斬拌兔肉糜加熱過程(20～80 ℃)中儲能模量(G′)的影響Fig.3 Effects of high-pressure processing of pre-rigor rabbit muscle on storage modulus(G′) of the chopped rabbit meat batters

其中200 MPa-15 s處理組的G′值最高，且其與100 MPa-180 s處理組沒有顯著性差異(P>0.05)。 值得注意的是，這2個處理組樣品在加熱過程中的第一個G′峰消失，在45 ℃左右G′下降，在51 ℃左右開始急劇增加。另外，其他處理組的第一個G′峰與對照組相比都有不同程度的減弱。該現象說明，僵直前對兔肉進行超高壓處理改變了兔肉中蛋白質，尤其是肌球蛋白的分子的理化特性，如蛋白二級結構、空間構型以及/或蛋白分子之間的作用力。

表1 超高壓處理僵直前兔肉對斬拌兔肉糜流變特性(20 ℃，80 ℃)的影響Table 1 Effects of high-pressure processing of pre-rigor rabbit muscle on the rheological properties of the chopped rabbit meat batters

注：表中每一列中不同字母表示結果差異顯著(P<0.05)。

對比圖4中不同處理兔肉糜的相位角正切值(tanδ)發現，6組超高壓處理不同程度上影響了肉糜蛋白體系在加熱過程中的相轉變過程以及肉糜的黏彈(viscosity)特性。其中，300 MPa-180 s處理組的tanδ值在升溫過程中變化最為劇烈，100 MPa-180 s和200 MPa-15 s處理組肉糜的tanδ值在升溫過程中變化過程最為平緩。

1-對照組；2-100 MPa處理15 s；3-100 MPa處理180 s；4-200 MPa處理15 s；5-200 MPa處理180 s；6-300 MPa處理15 s；7-300 MPa處理180 s圖4 超高壓處理僵直前兔肉對斬拌兔肉糜加熱過程(20～80 ℃)相位角正切值(tanδ)的影響Fig.4 Effects of high-pressure processing of pre-rigor rabbit muscle on tanδ of the chopped rabbit meat batters during heating

分析表1中7組樣品的初始tanδ和終點tanδ值發現，加熱前100 MPa-180 s和200 MPa-15 s處理組樣品的tanδ值顯著低于其他處理組(P<0.05)，但加熱終點的tanδ值高于對照組、100 MPa-15 s和300 MPa-180 s(P>0.05)處理組。這表明100 MPa-180 s和200 MPa-15 s處理組樣品的相對黏性高于對照組。

2.3 超高壓處理僵直前兔肉后斬拌兔肉糜動態流變特性與蛋白二級結構主成分分析

圖5所示是樣品流變特性與其蛋白質二級結構主成分分析的雙重結果圖(bi-plot)，藍色正方形代表的是不同處理的評分圖(score plot)，而紅色三角形則代表的是不同指標之間載荷圖(loading plot)。

圖5 超高壓處理僵直前兔肉后斬拌兔肉糜流變特性與蛋白質二級結構主成分分析Fig.5 Principle component analysis of rheological properties and protein secondary structures of rabbit meat batter with various high-pressure processing of pre-rigor rabbit muscle

主成分1和主成分2占比為50.5%和33.8%， 共計84.3%，因此可以在主成分1和2的基礎上對結果進行分析。100 MPa-180 s、200 MPa-15 s、200 MPa-180 s以及300 MPa-15 s都處于二、三象限，對照組、100 MPa-15 s和300 MPa-180 s同歸于一、四象限，說明100 MPa-15 s和300 MPa-180 s 超高壓處理后的凝膠品質與對照組相近，而其他高壓處理組的凝膠性質與對照組相比發生了顯著改變。另外，從指標的分布來看，初始G′，β-折疊和終點tanδ距離近，且都落在一、四象限遠離x軸零點的位置，同時α-螺旋遠離x軸零點，落在第一象限；而無規卷曲和終點G′、β-轉角和初始tanδ則落在了遠離y軸中點的位置，且方向相反。由此認為，對僵直前的兔肉采用中等程度(100 MPa-180 s、200 MPa- 15 s、200 MPa-180 s以及300 MPa-15 s)的高壓處理會使兔肉糜中的肌原纖維蛋白α-螺旋相對含量降低，同時β-折疊相對含量增加，使肉糜加熱前彈性增加，且加熱形成凝膠后擁有中等黏彈性質的凝膠品質。

3 討論

蛋白的二級結構通常被認為與加熱形成凝膠后蛋白凝膠的功能特性相關[17]。HERRERO等[18]研究發現，蛋白質β-折疊和β-轉角的相對含量與加熱形成的凝膠的硬度，彈性以及內聚性有顯著的正相關關系，而與凝膠的表面黏附性呈負相關關系。XU等[12]在對豬肉肌原纖維蛋白加熱凝膠形成過程的研究中，也發現了類似的規律。因此結合本試驗結果可以推斷，對僵直前的兔肉采用適當的超高壓處理，可以改善兔肉凝膠的質構特性，如適當增加凝膠硬度，適當降低黏彈比例等[11]。

蛋白體系的動態流變特性能夠反映蛋白體系在特性條件下體系中蛋白之間的相互作用結果。一般認為，蛋白體系的儲能模量(G′)能反映體系的彈性，而損耗模量(G″)則能反映體系的黏性相關信息，體系的相轉變過程由相位角的值來體現[19]。本研究通過分析肉糜的G′和相位角正切值(tanδ=G″/G′)，探討超高壓處理僵直前的兔肉對其斬拌肉糜的凝膠特性影響。研究發現，僵直前對兔肉進行超高壓處理改變了兔肉中蛋白質，尤其是肌球蛋白的理化性質。根據前人的研究推測，這可能是因為超高壓處理過的樣品在斬拌后所釋放的肌球蛋白之間的相互作用發生改變，更傾向于蛋白之間弱交聯的形成，從而表現出更高的G′[13]。在此基礎上，經過加熱形成的凝膠網絡結構的交聯方式也極有可能不同，最終表現為加熱終點凝膠的G′大小的差異[20]。

300 MPa-180 s處理組的tanδ值變化最為劇烈，說明其蛋白體系的作用力在加熱過程中較其他處理組發生了更加劇烈的變化[21]，這可能與不同高壓處理對肉糜中蛋白的變性程度不同有關[22]。而100 MPa-180 s和200 MPa-15 s處理組肉糜的tanδ值變化過程最為平緩，意味著這2組肉糜樣品在加熱過程中，尤其是加熱前期(20～50 ℃)，樣品的狀態在該升溫區間的相轉變程度小且整體變化均勻。

通過比較不同處理組的初始和終點tanδ值發現，100 MPa-180 s和200 MPa-15 s處理組樣品具有更高的相對黏性。結合之前的研究結果[11]，這2組處理樣品的硬度和彈性都高于對照組。綜上分析，100 MPa-180 s和200 MPa-15 s處理組樣品的凝膠產品應該擁有更受消費者青睞的品質以及黏彈適中的口感。

不同處理組分布在不同象限，該結果的出現，很可能是由于100 MPa-15 s壓力小，作用時間短，不足以對肌肉中的蛋白起到明顯改變作用，而300 MPa-180 s處理反而對蛋白質的性質的改變，如二級結構變化具有限制作用，導致功能特性改變不顯著，最終形成了與對照組類似的凝膠品質。而其他處理組的作用適中，使其凝膠性質與對照組相比發生了顯著改變。中等程度的高壓處理如100 MPa-180 s、200 MPa-15 s、200 MPa-180 s或300 MPa-15 s同樣對指標分布產生顯著影響，這進一步說明，中等程度的超高壓處理會對后續斬拌加熱后形成的的凝膠品質產生影響。

4 結論

綜上分析，對僵直前的兔肉進行中等程度(100 MPa-180 s、200 MPa-15 s、200 MPa-180 s以及300 MPa-15 s)的超高壓處理能夠通過修飾蛋白質二級結構等理化特性來達到改變最終熱凝膠功能特性的目的。以流變特性變化為例，200 MPa-15 s的超高壓對僵直前的兔肉進行預處理，能夠改善其斬拌肉糜粘彈性以及相應熱凝膠的彈性。100 MPa-15 s超高壓處理對兔肉蛋白結構和最終凝膠特性沒有顯著影響(P>0.05)。 300 MPa-180 s超高壓處理會對蛋白結構產生顯著影響，但是對最終凝膠的黏彈特性沒有效果。本次試驗為超高壓處理改善肉類產品質量提供了理論依據，有利于促進超高壓技術在肉品加工領域的應用。