高通量測序結合傳統培養分析常溫油沙冰皮月餅的菌群多樣性

阮征，魏力，張延杰，夏雨，李汴生*

1(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510640) 2(廣東省天然產物綠色加工與產品安全重點實驗室，廣東 廣州，510640) 3(咀香園健康食品(中山)有限公司，廣東 中山，528400)

根據GB19855—2015中的定義，冰皮月餅以糯米粉，大米淀粉，玉米淀粉等為餅皮的主要原料，經熟制后制成餅皮，包裹餡料，并經成型，冷藏(或不冷藏)等冷加工工藝制成的口感綿軟的月餅[1-2]。冰皮月餅相比于傳統月餅，為了保持其本真原料的外觀色澤(例如熟糯米粉制備的月餅外觀潔白如雪，故以“冰皮”命名)，一般不經過烤制處理，采用冷加工工藝，要求在潔凈度較高的環境下加工。然而，即便如此，由于原輔料營養豐富，加工過程缺乏殺滅或抑制微生物生長的控制措施，導致冰皮月餅，尤其是常溫貯存的產品存在較大的安全隱患，往往需要通過添加抑菌物質等手段來提高其保藏性。其中月餅中芽孢桿菌和霉菌對環境的耐受力很強，較難控制，對其原輔料和加工過程的菌群多樣性進行分析，才能更有效地進行追溯和防控。

隨著科學技術的發展，研究食品腐敗微生物的方法越來越多。高通量測序作為新一代測序技術的代表，所包含信息量大，但是信息的歸類整合模糊，無法區分死菌與活菌，因此常常需要輔助另外一些手段進行研究[3-6]。傳統培養技術可培養的條件有限，對于絕大多數微生物并不能很好地富集和分離，而且培養周期長，但成本低、分離出的菌體純度高，在微生物研究中仍有重要地位，可以作為高通量測序技術的補充，同時傳統培養技術能更好更準確地區分活菌和死菌，因此高通量測序技術結合傳統培養技術能更加真實準確地反映系統中的活菌情況[7-10]，這樣有助于更準確地研究系統中的腐敗微生物。曹榮等[9]利用高通量測序技術和傳統純培養技術研究牡蠣微生物群落，發現2種方法得到的結果一致。

關于月餅腐敗菌的研究主要集中在傳統烘焙型月餅的霉菌群系上，黃愷婷[11]對廣式月餅腐敗霉菌進行了分離，發現導致廣式月餅敗壞的霉菌以曲霉菌和青霉菌為主；陳盼[12]對廣式月餅中的微生物區系進行研究，發現微生物群系以細菌為主，其次是霉菌和酵母菌；顧媛等[13]研究肉制品月餅微生物群系，發現霉菌主要有灰綠曲霉、雜色曲霉和黃曲霉。目前對于冰皮月餅腐敗微生物的群系研究鮮有報道。本研究選擇未添加抑菌物質的油沙冰皮月餅(餡料為油性豆沙)為研究對象，以高通量測序和傳統培養為手段，研究常溫貯藏樣品的微生物菌群結構和主要來源，在不影響冰皮月餅特征感官品質的前提下，探究包裝前短時間熱處理和紫外線處理對菌群狀況的影響，以期為常溫冰皮月餅的安全性控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油性豆沙餡料、冰皮月餅預拌粉、麥芽糖漿、白奶油，市售。

1.2 試驗方法

冰皮月餅制作流程：清水與麥芽糖漿混合煮沸；取冰皮預拌粉與混合液混合慢速攪拌，分2次加入白奶油，攪拌成型；取出面團，整形分割；包裹餡料，模具成型；包裝(添加脫氧劑)。

鑒于熱處理和紫外線處理是常用的微生物控制的物理方法，在不影響冰皮月餅固有外觀品質的前提下，對包裝前的樣品進行短時熱處理(170 ℃, 8 min)和紫外處理(250～270 nm, 30 min)，探討2種手段對常溫冰皮月餅微生物控制的可行性(操作環境經過30 min紫外處理，所有接觸表面經過酒精消毒，經環境檢驗符合國家標準)。

樣品標注為對照樣，紫外線處理，熱烘+紫外線處理。樣品未添加抑菌物質，置于25 ℃下貯存備用。

1.3 檢測與方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化及鑒定[14-17]

常溫冰皮月餅腐敗菌分離純化：過程樣及成品于無菌操作臺上用體積分數75%酒精擦拭無菌包裝表面后，共取25 g樣品置入225 mL的無菌生理鹽水中，均質5 min，無菌生理鹽水做梯度稀釋10-1、10-2、10-3、10-4。從以上稀釋度菌液中各取0.1 mL在選擇性培養基平板上涂布均勻，培養條件及培養基種類如表1所示。然后觀察各平板菌落形態及分布，挑取典型菌落平板劃線直至出現單一菌落，挑取純菌落于肉湯培養過夜，4 ℃保存備用。純培養腐敗菌的生化鑒定：分離純化菌株依據伯杰氏細菌手冊和真菌鑒定手冊進行鑒定，結果如表1所示。

1.3.2 高通量測序技術檢測微生物多樣性[18-20]

1.3.2.1 DNA抽提和純度檢測

在超凈工作臺稱取25 g成品樣品放入裝有225 mL 生理鹽水的無菌均質袋中，均質5 min，無菌操作取2 mL均質液至無菌離心管，放入離心機3 000 r/min離心1 min，吸取離心管中上清液至2 mL無菌離心管中，放入高速冷凍離心機，4 ℃，12 000 r/min離心2 min， 棄去上清液，離心沉淀按照細菌基因組試劑盒方法提取細菌基因組DNA，并利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA純度。

1.3.2.2 PCR擴增及測序

基因組DNA采用16SrDNA的引物338F_806R(338F，5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG- 3′，806R，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)對V3可變區進行擴增，PCR擴增條件預變性1個循環(95 ℃，3 min)， 擴增30個循環(變性95 ℃，30 s；退火60 ℃， 30 s；延伸72 ℃，45 s)，最后72 ℃延伸10 min；PCR反應體系為5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，Forward Primer(338F,5 μmol/L) 0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，ddH2O 11.8 μL。PCR擴增產物用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物進行定量檢測，并進行混樣，用質量分數為2%的瓊脂糖凝膠電泳進行純度檢測，使用試劑盒回收PCR產物。由上海美吉生物構建PE擴增子文庫，并使用Illumina Miseq平臺進行測序。

1.3.3 單種純化菌落鑒定方法[21-24]

1.3.3.1 純化菌種DNA提取

取37 ℃肉湯培養的菌液3 mL，12 000 r/min離心1 min，棄去上清液，加入0.5 mL TE懸浮沉淀，并加入75 μL，50 mg/mL溶菌酶溶液，30 ℃保溫10 min， 加入體積分數10% SDS，5 μL蛋白酶K，混勻，37 ℃保溫30 min，加入0.75 mL，5 mol/L NaCl，混勻，用V(苯酚)∶V(氯仿)∶V(異戊醇)=25∶24∶1抽提，12 000 r/min離心1 min，將上清液移至干凈離心管，用V(氯仿)∶V(異戊醇)=24∶1抽提，靜置10 min， 12 000 r/min離心1 min，轉移上清液干凈管，加2倍體積乙醇沉淀DNA，混合，室溫靜置10 min，離心沉淀DNA，70%乙醇漂洗DNA后，用3050 TE溶解DNA備用。

1.3.3.2 PCR擴增及測序

基因組DNA采用引物27F_1492R 引物(27F:5′-AGAGTTTGATCCGGCTCAG- 3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)進行擴增，PCR反應體系為2×Taq Plus Master Mix 10 μL，5p 27F 0.8 μL，5p 1492R 0.8 μL，Template 1.0 μL，ddH2O 7.4 μL；PCR擴增條件預變性1個循環(95 ℃，5 min)，擴增35個循環(變性95 ℃，30 s；退火55 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s)， 最后72 ℃延伸10 min；PCR擴增產物用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,使用試劑盒回收PCR產物并測序，結果在NCBI文庫中進行比對。

1.4 數據處理

分析圖采用Excel 2016，Origin 7進行處理；采用SPSS 21.0進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 冰皮月餅成品菌群的構成分析

圖1反應的是對照樣高通量測序的結果，該結果反映從樣品中共分離鑒定出16個屬，分別為藍細菌屬(Cyanobacteria)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)，不動桿菌屬(Acinetobacter)，鏈球菌屬(Streptococcus)，黃單胞菌屬(Xanthomonas)，乳球菌屬(Lactococus)，腸桿菌屬(Enterobacter)，紅球菌屬(Rhodococcus)，氣單胞菌屬(Aeromonas)以及金黃桿菌屬(Chryseobacterium)等。其中微生物屬豐度前3的屬為藍細菌屬，葡萄球菌屬和不動桿菌屬。對照樣進行傳統分離培養，共分離得到6株菌株，經鑒定得到葡萄球菌屬占16.67%，芽孢桿菌屬占50.00%，未知屬占33.33%；結合高通量測序，可知樣品中存在的葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬占有較大的比例。傳統分離培養技術從對照樣中分離得到3株霉菌，分別為毛霉，青霉和曲霉；而食品中的腐敗菌主要包括細菌，酵母和霉菌，其中細菌主要包括芽孢桿菌屬，假單胞菌屬，葡萄球菌屬和黃桿菌屬等，這些微生物屬對于蛋白質類食品，碳水化合物類食品和脂肪類食品表現為不同的分解能力，但是作為腐敗菌總體皆表現為對營養物質和感官的破壞。結果表明，本研究中冰皮月餅的主要腐敗細菌為芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬。

圖1 樣品微生物屬的相對豐度Fig.1 The relative abundance of different samples

2.2 短時熱烘結合紫外線處理對冰皮月餅菌群結構的影響

圖2反映的是經過短時熱處理和紫外處理的成品樣品高通量測序的結果，該結果反映從樣品中共分離鑒定出14個屬，結果同對照樣的菌群結構相似，表明短時熱處理和紫外處理對菌群結構影響不大；其中經過短時熱處理和紫外處理的成品樣品中微生物屬豐度前三的屬為藍細菌屬，相對豐度分別為29.89%，39.79%；芽孢桿菌屬，相對豐度分別為20.62%，19.38%； 葡萄球菌屬，相對豐度分別為11.70%，9.58%；結果與對照樣有差異，說明短時熱處理和紫外線處理雖然對菌群結構組成影響不大，但是能夠影響不同菌群之間的相對豐度。同樣傳統分離培養技術從經過短時熱處理和紫外處理的成品樣品中分離得到3株霉菌，分別為毛霉，青霉和曲霉，說明短時熱處理和紫外處理對于霉菌的種類影響不大。

圖2 樣品微生物屬的相對豐度Fig.2 The relative abundance of different samples

2.3 冰皮月餅常溫貯藏過程微生物數量的變化

圖3反映的是樣品貯藏過程中微生物數量的變化情況。根據高通量測序結果和傳統培養技術得出，實驗用冰皮月餅主要存在的腐敗菌為葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬，因此探究腐敗菌屬葡萄球菌和芽孢桿菌在貯藏過程中的變化對于了解和控制腐敗菌的生長有利。(1)反映隨貯藏時間的延長樣品中菌落總數、芽孢桿菌和霉菌呈現顯著性增長(P<0.05)，而葡萄球菌屬的數量呈現顯著性降低的趨勢(P<0.05)；(2)反映了微生物的變化隨貯藏時間變化的關系，同樣得出與(1)一樣的變化趨勢；經過短時間的熱處理和紫外處理，樣品中的菌落總數增加，而葡萄球菌數量呈現下降的趨勢，但是短時間的熱處理對于霉菌和芽孢桿菌的影響較小。未經過熱處理的樣品在貯藏30 d時，菌落總數達到1 280 CFU/g，超過標準(≤1 000 CFU/g)的1.2倍，而經過短時間熱處理的樣品在40 d后微生物才超標(1 039 CFU/g)，表明短時熱處理對微生物的生長有抑制作用。通過前面的分析，樣品中主要存在的腐敗微生物芽孢桿菌屬有較強的抗逆性，在貯藏過程中呈現顯著性增長趨勢，因此采取有效的措施從原料入手，才能減少樣品中的微生物污染。

a-紫外線處理；b-熱烘+紫外線處理圖3 樣品貯藏過程中微生物變化Fig.3 Microbial changes of samples during storage

2.4 冰皮月餅常溫貯藏過程水分活度的變化

貯藏過程中，冰皮月餅皮料和餡料水分活度的變化如圖4所示。

a-皮料水分活度；b-餡料水分活度圖4 樣品貯藏期間水分活度變化Fig.4 Changes in water activity during storage of samples

其中在貯藏過程中，皮料水分活度呈現顯著降低的趨勢，而餡料水分活度變化不顯著。食品貯藏穩定性與水分活度存在一定關系，其中對于微生物來說，大部分細菌在水分活度低于0.90時無法繁殖，大部分霉菌可在0.80～0.87生長；且樣品的皮料的水分活度分別從0.836下降到0.756(P<0.05)，從0.833到0.762 (P<0.05)，說明實驗樣品在貯藏過程中水分活度呈現顯著性降低的趨勢，大部分微生物的生長受到抑制。

2.5 腐敗微生物溯源分析

表2反映的是微生物生理生化鑒定結果與NCBI文庫序列比對結果。傳統微生物培養技術從原料，過程樣和成品共分離得到55株細菌和6株霉菌(其中毛霉占33.33%，青霉占16.67%，曲霉占50.00%)；經形態學檢驗和生理生化鑒定，發現芽孢桿菌屬(Bacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)比例較高，分別為58.18%，12.72%；依據初步鑒定結果劃分為 11株不同細菌，其中從原料到成品都存在的微生物包含4株，分別為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ。

表2 NCBI序列對比結果Table 2 NCBI sequence comparison results

其中Ⅰ，Ⅲ及毛霉分離來源于冰皮月餅預拌粉；Ⅱ，Ⅳ，青霉和曲霉分離來源于餡料。根據伯氏細菌手冊鑒定Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，黃單胞菌屬(Xanthomonas)，芽孢桿菌屬(Bacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，且分離得到的這些微生物是樣品中的有害微生物。考慮到傳統生理生化鑒定存在一定的局限性，對純化的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ菌株進行進一步的鑒定，通過基因提取，PCR擴增，其結果登錄NCBI進行序列比對，如表2所示，發現在NCBI文庫中，Ⅰ鑒定屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，Ⅱ鑒定屬于寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)，Ⅲ鑒定屬于類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)，Ⅳ鑒定屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，且與NCBI其他已知微生物基因序列相似性達到99%，此結果與傳統純培養和高通量測序結果相似，發現從樣品中存在的腐敗微生物主要為芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，且一直存在于整個加工過程中的腐敗細菌為芽孢桿菌屬，寡樣單胞菌屬和類芽孢桿菌屬，并主要來自于原料粉料和餡料，所以原料中原有的微生物是導致樣品微生物污染的主要來源。

3 結論

本文采用高通量測序和傳統分離培養的方法分析了常溫油沙冰皮月餅的微生物菌群結構，發現兩種方法的檢測結果具有較好的一致性。

從研究結果上看，在屬的水平上，經過短時熱處理和紫外處理的油沙冰皮月餅菌群中豐度前三位的菌屬為藍細菌屬(Cyanobacteria)，芽孢桿菌屬(Bacillus)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)，且芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬是其主要腐敗有害微生物，而藍細菌屬對樣品腐敗幾乎沒有影響；且經過不同處理，盡管菌群結構相似，但不同種屬之間相對豐度有差異，兩種處理方式能降低樣品中的微生物數量。結合傳統培養技術，分析成品中微生物的來源發現，分離得到的微生物主要來源于各種原料，其中含量較多的芽孢桿菌屬主要來源于粉料，霉菌主要來源于粉料和餡料；隨著貯藏時間的延長，其中樣品的菌落總數，芽孢桿菌和霉菌呈現顯著性增加的趨勢，而葡萄球菌呈現顯著性降低的趨勢，因為隨著貯藏時間的延長，樣品的水分活度呈現降低的趨勢，對于抗逆性較強的霉菌和芽孢桿菌，更加能適應較惡劣的環境。

包裝前短時間熱處理和紫外線處理對于冰皮月餅中的微生物有一定的影響，但是處理強度過高會影響冰皮月餅的特有感官品質，因此僅僅依靠強度有限的熱烘和紫外處理難以達到常溫貯存所需的殺菌或抑菌程度。一方面，鑒于芽孢桿菌、霉菌等主要污染微生物大多屬于好氧微生物，在月餅包裝袋中添加脫氧劑可以提供一種有效的保藏途徑；另一方面，有針對性地控制冰皮月餅的初始微生物污染程度將有助于貯存期的延長。結果顯示原輔料是常溫冰皮月餅的主要微生物污染源，因此皮料餡料等的衛生安全水平將直接影響終產品的安全性和貯存期。