乳化揮發(fā)法和薄膜-超聲法制備阿魏酸固體脂質納米粒工藝比較

高藝敏，張震，陳佩敏，陳欽，周允瑩,汪勇，張寧*

1(暨南大學 食品科學與工程系，廣東高校油脂生物煉制工程技術研究中心，廣東 廣州，510632) 2(廣東省糧油副產物生物煉制工程技術研究中心，暨南大學“油料生物煉制與營養(yǎng)”聯(lián)合實驗室，廣東 廣州，510632)

阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)是植物酚酸的重要組成部分，廣泛存在于果蔬及種子皮殼中[1]。阿魏酸是一種天然的抗氧化劑[2]，具有抗氧化和清除自由基、抗血小板凝集、促進解聚、抗血栓形成、提高細胞膜穩(wěn)定性，以及抗炎、調節(jié)免疫等多種功能，因此在醫(yī)藥、食品、化妝品等領域得到了越來越廣泛的應用[3-4]。雖然阿魏酸的功能多樣，適用范圍廣，但是性質不穩(wěn)定，易受溫度、光線、pH等因素影響[5]，其中溫度和pH對其影響較大,這也在一定程度上限制了其在食品中的應用。

固體脂質納米粒(solid lipid nanoparticles, SLNs)是一種新型的緩釋系統(tǒng)[6]，以天然或合成的脂質為基質,將生物活性化合物包裹于其中，制成粒徑為50～1 000 nm的固體脂質粒子，可以有效地提高生物活性化合物的生物利用度[7]，控制其釋放，避免其氧化和降解[8]。研究表明，將生物活性化合物制備成SLNs后[9]，其口服生物利用度顯著增強[10-12]。OEHKLE等將阿魏酸和姜黃素，通過熱高壓均質的方法，將其負載于SLNs，延緩其釋放速度[13]。

SLNs的制備方法主要有：高壓均質法、薄膜超聲法、乳化溶劑揮發(fā)法、冷凍干燥法等[14-17]。溶劑揮發(fā)法將油脂溶解在有機溶劑里，在非有機溶劑中進行揮發(fā)，從而形成SLNs，該方法適合負載熱敏性的活性物質，并且不需要復雜的設備，容易放大生產；薄膜-超聲法通過超聲將固體脂質分散到水相，從而形成SLNs，該方法技術簡單，成本低[18]。本研究分別用薄膜-超聲法和乳化揮發(fā)法，將阿魏酸包裹于單硬脂酸甘油酯，制成阿魏酸固體脂質納米粒(FA-SLNs)，篩選更加適合制備穩(wěn)定FA-SLNs體系的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

阿魏酸，美國Sigma公司；卵磷脂，上海麥克林生化科技有限公司；單硬脂酸甘油酯，美純上海商貿有限公司；聚醚F-68，上麥克林生化科技有限公司；吐溫80，天津市富宇精細化工有限公司；JY98-ⅢD超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物技術股份有限公司；Zetasizer Nano ZS納米激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；TECNAI10透射電子顯微鏡，美國FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳化揮發(fā)法制備FA-SLNs

通過單因素試驗研究卵磷脂的添加量(質量分數8%、16%、32%)，單硬脂酸甘油酯的添加量(質量分數0%、40%、80%、95%)，聚醚F-68溶液的質量濃度(5、10、20 g/L)對于FA-SLNs的影響。每個水平分別制定3個樣品，然后測量所得FA-SLNs的平均粒徑、電位和包封率。

稱取一定量的阿魏酸和卵磷脂，用無水乙醇溶解，加入一定量的單硬脂酸甘油酯加熱溶解組成有機相。配制一定濃度的聚醚F-68溶液作為水相待用。在70 ℃下用5號針頭緩慢地將有機相注射入不斷攪拌中的水相，所得混合物加熱濃縮至6 mL。將濃縮后的半透明體系用5號針頭快速注入25 mL 10 g/L的吐溫80溶液(0～2 ℃)中，冰浴攪拌2 h，得到FA-SLNs 混懸液。同等條件下，不加入阿魏酸，制備空白FA-SLNs混懸液。

1.2.2 薄膜-超聲法制備FA-SLNs

通過單因素試驗研究超聲時間(5、10、15 min)，卵磷脂的添加量(質量分數55%、75%、95%)對于FA-SLNs 的影響。每個水平分別制定3個樣品，然后測量所得FA-SLNs的平均粒徑、電位和包封率。

稱取阿魏酸40.0 mg，加入3 mL無水乙醇溶解，稱取一定量的卵磷酯，加入10 mL氯仿溶解，將兩者混合。轉移至圓底燒瓶內，用微型漩渦混合儀震蕩1 min， 在45 ℃、50 r/min的條件下旋轉蒸發(fā)，抽真空5 min，制成脂質薄膜。真空干燥24 h，徹底除去有機溶劑。加入80 mL蒸餾水，用旋轉蒸發(fā)器在50 ℃、80 r/min 的條件下旋轉1 h，將燒瓶內液體轉移至燒杯中，使用超聲波細胞粉碎機120 W超聲一定時間，其中超聲間隔5 s，制得FA-SLNs混懸液。

1.2.3 包封率的測定方法

采用紫外分光光度法測定阿魏酸濃度[19]，標準曲線如圖1所示。

圖1 紫外-可見分光光度計法測定阿魏酸標準曲線Fig.1 Determination of ferulic acid standard curve by ultraviolet-visible spectrophotometry

取適量混懸液，用100 K(膜孔直徑為5.5 nm)規(guī)格的超濾離心管5 000 r/min離心5 min，分別收集透過的清液和未透過的上懸液。用乙醇對離心后的下清液和上懸液分別稀釋10倍和100倍，搖勻后，在318 nm處測量其吸光度。包封率按公式(1)計算：

(1)

式中：C1，上層清液中的阿魏酸濃度，%;C2，下層濁液中的阿魏酸濃度，%。

1.2.4 形態(tài)觀察

將FA-SLNs用蒸餾水適當稀釋，取1～2滴，滴在銅網上，自然晾干后，再用質量濃度為20 g/L的磷鎢酸負染，在透射電鏡下觀察并拍照，觀察其粒徑大小和形態(tài)。

1.2.5 粒徑、電位測定

用納米激光電位粒徑分析儀測定FA-SLNs的粒徑、粒徑分布和電位。

1.2.6 穩(wěn)定性考察

取薄膜-超聲法和乳化溶劑揮發(fā)法最優(yōu)條件下制得的樣品各一個，儲存在4 ℃冰箱，分別在0，7，14，21 d時，測定其平均粒徑和電位，觀察其外觀，評價其穩(wěn)定性。每個樣品3組平行。

2 結果與分析

2.1 乳化溶劑揮發(fā)法工藝優(yōu)化結果

2.1.1 卵磷脂的加入量對FA-SLNs的影響

單硬脂酸甘油酯的添加量為80%(質量分數)，聚醚F-68 溶液的質量濃度為10 g/L，改變卵磷脂加入量，所得結果如表1所示。

表1 卵磷脂加入量對FA-SLNs的影響Table1 Effect of lecithin addition on FA-SLNs

注：a、b、c不同字母代表2個數據有差異性，相同字母代表2個數據無差異性。下同。

卵磷脂的添加量由8%增加到16%，F(xiàn)A-SLNs 的包封率由67.86%上升至69.54%，這是因為卵磷脂可溶于單硬脂酸甘油酯中，從而形成分子型的固體分散體，破壞單硬脂酸甘油酯的晶格的完整性，增加不規(guī)則性，從而包裹更多的阿魏酸[20]。但是當卵磷脂的加入量達到32%時，F(xiàn)A-SLNs的包封率反而降低到66.57%，這說明當卵磷脂的加入量達到一定程度，并不會使單硬脂酸甘油酯的包封效果得到進一步的提高，這可能是單硬脂酸甘油酯和阿魏酸的結合達到了飽和。因此卵磷脂加入量為16%時所制得的FA-SLNs平均粒徑最小，包封率最高。Zeta電位絕對值代表體系穩(wěn)定性大小，絕對值越大，體系越穩(wěn)定[21]。卵磷脂的加入量對FA-SLNs體系的Zeta電位影響不大。因此，卵磷脂的適宜為16%。

2.1.2 單硬脂酸甘油酯加入量對FA-SLNs的影響

卵磷脂的添加量為16%(質量分數)，聚醚F-68溶液的質量濃度為10 g/L，改變單硬脂酸甘油酯的加入量，所得結果如表2所示。

表2 單硬酯酸甘油酯用量對制備結果的影響Table 2 Effect of monosterol glyceride dosage on preparation results

單硬脂酸甘油酯的加入量由0 mg增加到80%(質量分數)時，F(xiàn)A-SLNs的平均粒徑由158.58 nm下降到115.77 nm，包封率由68.62%上升到72.91%。 這是因為單硬脂酸甘油酯過少時，過多的阿魏酸難以被載入到脂質的晶格中[22]，僅僅是增加了溶液中游離的阿魏酸的含量。增加單硬脂酸甘油酯的含量，可以使單硬脂酸甘油酯和游離的阿魏酸更好的結合，包封效果更好，也可以避免游離的阿魏酸因為分子間作用力而聚集在一起，從而使體系更加的分散，形成的顆粒更小。當單硬脂酸甘油酯的加入量為0時，仍然有包封率，這說明卵磷脂作為磷脂類材料，自身也可以和阿魏酸結合[21]，但是沒有和單硬脂酸甘油酯一起使用的效果好。但是當單硬脂酸甘油酯的加入量達到95%，F(xiàn)A-SLNs的平均粒徑反而上升到143.13 nm，包封率下降到66.89%。這可能是因為過量的單硬脂酸甘油酯使分散體系變得黏稠而且不穩(wěn)定，粒子之間的距離變小，容易聚集在一起，不容易和阿魏酸結合，從而導致粒徑增大，包封率下降。單硬脂酸甘油酯的加入量對FA-SLNs體系的Zeta電位影響不大。因此，單硬脂酸甘油酯的適宜添加量為80%(質量分數)。

2.1.3 聚醚F-68溶液濃度對FA-SLNs的影響

聚醚F-68作為乳化劑，能夠改善乳液中各個組分之間的表面張力，使分散體系更加的均勻穩(wěn)定。卵磷脂添加量為16(質量分數)，單硬脂酸甘油酯的添加量為80%(質量分數)，改變聚醚F-68的質量濃度，結果如表3所示。聚醚F-68溶液的質量濃度由5 g/L上升到10 g/L時，F(xiàn)A-SLNs的平均粒徑由143.83 nm降低到127.80 nm,包封率由63.75% 上升到65.36%。

表3 聚醚F-68溶液濃度對制備結果的影響Table 3 Effect ofconcentration of polyether F-68 solution on preparation results

這是因為一定量的乳化劑不僅可以使乳液體系更加分散，還有增溶作用，可以使阿魏酸更好地溶解在單硬脂酸甘油酯里面，從而提高包封率[23]。乳化劑用量增大可以使微乳體系分散得更好，平均粒徑也隨之下降[23]。當聚醚F-68的質量濃度增加至20 g/L，F(xiàn)A-SLNs的平均粒徑上升到154.27 nm，包封降低為54.29%，電位絕對值最小。這說明乳化劑的增溶作用是有一定限度，當聚醚F-68質量濃度為10 g/L時，增溶作用最大[23]。聚醚F-68為非離子型表面活性劑，因此其加入量對體系的Zeta電位影響不大。因此，聚醚F-68的適宜質量濃度為10 g/L。

2.2 薄膜-超聲法工藝優(yōu)化結果

2.2.1 卵磷酯添加量的影響

超聲時間5 min，超聲功率120 W，改變卵磷脂的添加量，所得結果如表4所示。

表4 卵磷脂加入量對FA-SLNs的影響Table 4 Effect of lecithin addition on FA-SLNs

結果表明，卵磷酯的添加量由55%(質量分數)增加到95%(質量分數)時，F(xiàn)A-SLNs的平均粒徑先下降再上升，變化趨勢不大。包封率由55.92%上升到62.97%。因為卵磷脂是磷脂類材料[24]，本身有一定的乳化作用，在添加量增加時，會使體系分散性更好，乳液更均勻穩(wěn)定，但達到一定濃度的時候，反而會使乳液體系變得粘稠，納米粒子更容易聚集在一起。增加卵磷脂的添加量，可以負載更多游離的阿魏酸，因此包封率會逐漸增大，當阿魏酸在卵磷脂中的溶解度趨于飽和時，包封率趨于穩(wěn)定。卵磷脂的添加量對于體系的Zeta電位影響不大。因此，卵磷脂的適宜添加量為75%(質量分數)。

2.2.2 超聲時間的影響

卵磷脂添加量為75%(質量分數)，超聲功率120W，改變超聲時間，所得試驗結果如表5所示。

表5 超聲時間對FA-SLNs的影響Table 5 Effect ofultrasound time on FA-SLNs

結果表明，隨著超聲時間由5 min延長到15 min，F(xiàn)A-SLNs的粒徑由46.00 nm下降到31.67 nm，包封率由60.62%上升到68.25%。由此可見延長超聲時間可以減小FA-SLNs的粒徑，提高其包封率，但是通過對樣品外觀的觀察發(fā)現(xiàn)，超聲時間為10 min、15 min 會有黑色顆粒物質生成，可能是因為10 min、15 min的超聲時間過長，超聲探頭溫度過高，導致油脂被燒焦。因此，超聲時間選擇5 min。

2.3 FA-SLNs的形態(tài)

分別在薄膜-超聲法和乳化揮發(fā)法的適宜條件下制備FA-SLNs。FA-SLNs混懸液為乳白色半透明液體，肉眼未見不溶性成分，無渾濁、絮狀、分層現(xiàn)象。在透射電鏡(TEM)下觀察(圖2、圖3)，F(xiàn)A-SLNs呈類球形，粒徑分布較均勻。

圖2 乳化揮發(fā)法制得FA -SLNs懸浮液的TEM圖像Fig.2 TEM image of FA-SLNs suspension prepared by emulsification and volatilization

圖3 薄膜-超聲法制得FA-SLNs懸浮液的TEM圖像Fig.3 TEM images of FA-SLNs suspension prepared by thin film-ultrasonic method

但是通過對比可以看到，采用薄膜-超聲法制得的FA-SLNs更加均勻，乳化揮發(fā)法制備的FA-SLNs分散效果不好，阿魏酸和單硬脂酸甘油酯呈大顆粒聚沉。黑點為阿魏酸，圖2白點為單硬脂酸甘油酯，圖3白點為卵磷脂，黑點為阿魏酸。由圖3可以看出薄膜-超聲法制得的FA-SLNs的分散效果更好。

2.4 電位、粒徑、包封率的測量

分別在乳化揮發(fā)法和薄膜-超聲法的選定條件下，制取FA-SLNs，并用納米激光粒度儀進行電位、粒徑的檢測，用紫外分光光度計進行包封率的測定。每個樣品3組平行。由表6可知，乳化揮發(fā)法的制備的FA-SLNs粒徑相對較大，但是包封率高，而薄膜-超聲法的粒徑相對較小，但是對于阿魏酸的包封率相對較低。

表6 乳化揮發(fā)法和薄膜超聲法最優(yōu)條件下制備FA-SLNsTable 6 Preparation of FA-SLNs under the optimal conditions of emulsification volatilization and thin-film ultrasound

2.5 FA-SLNs的儲藏穩(wěn)定性

分別在乳化揮發(fā)法和薄膜-超聲法的適宜條件下，制取FA-SLNs，4 ℃下儲存，并在0,7,14,21 d，進行粒徑、電位測量。每個樣品3組平行。粒徑變化如圖4所示，電位變化如圖5所示。由圖5可知，乳化揮發(fā)法和薄膜-超聲法制得的FA-SLNs的粒徑隨著儲存時間的增長，粒徑逐漸增大，但是均在200 nm以下，穩(wěn)定性良好。由圖5可知，薄膜-超聲法制得的FA-SLNs電位相對穩(wěn)定，但是乳化揮發(fā)法制得的電位在第14天降低明顯，之后又增大，故薄膜-超聲法制得的FA-SLNs， 更加穩(wěn)定。分別在適宜制備工藝條件下，用2種方法制備FA-SLNs，在4 ℃條件下儲存21 d，其穩(wěn)定性如圖6所示。

圖4 FA-SLNs粒徑儲存變化Fig.4 Changes in particle size storage of FA-SLNs

圖5 FA-SLNs電位儲存變化Fig.5 Changes in potential storage of FA-SLNs

A-乳化揮發(fā)法;B-薄膜超聲法圖6 兩種方法制得的阿魏酸固體脂質納米粒儲存前后穩(wěn)定性對比照片F(xiàn)ig.6 Comparison on the stabilities of pre- and post-storage of FA-SLNs prepared by two methods

3 結論

本研究采用薄膜-超聲法和乳化揮發(fā)法成功制備了阿魏酸固體脂質納米粒(FA-SLNs)，并通過單因素實驗篩選出了這2種方法的適宜制備工藝。薄膜-超聲法的最佳制備工藝為：阿魏酸添加量10%(質量分數),卵磷脂90%(質量分數)，超聲時間5 min，超聲間隔5 s,超聲功率120 W。所得FA-SLNs的平均粒徑為44.33 nm，Zata電位為-12.35 mV，包封率為62.97%。乳化揮發(fā)法的最佳制備工藝為：阿魏酸添加量4%(質量分數)，卵磷脂16%(質量分數)，單甘酯82%(質量分數),聚醚F-68的質量濃度為10 g/L。得FA-SLNs的平均粒徑為141.37 nm，Zeta電位為-10.25 mV，包封率為69.54%。通過電鏡觀察，薄膜-超聲法的粒徑更小，結構更均勻。2種方法制得的FA-SLNs在4 ℃ 下儲藏穩(wěn)定性良好。卵磷脂作為天然的表面活性劑，具有乳化作用，在食品行業(yè)有非常廣闊的應用，不僅可以作為發(fā)酵產品的催長劑，而且可以作為油炸食品的發(fā)泡劑[23]。薄膜-超聲法結果表明，卵磷脂既可以作為脂質材料較好的負載阿魏酸，又可以利用本身的乳化作用，使FA-SLNs可以長時間保持穩(wěn)定。用薄膜-超聲法和乳化揮發(fā)法制備FA-SLNs可行，并且粒徑較小，但是存在容易局部溫度過高，不容易產業(yè)化生產的缺陷。