氧化程度對肌原纖維蛋白理化特性和凝膠水分分布的影響

李玲，郭燕云，周怡

(臨沂大學 生命科學學院，山東 臨沂，276000)

肌原纖維蛋白是肉類中含量最高最重要的蛋白質，占總蛋白的55%～60%，其主要功能特性是能夠形成熱誘導凝膠，從而賦予肉類制品良好的質地和口感。肉類產品在加工過程中很容易發生蛋白質氧化從而導致產品質量下降，營養價值降低，甚至影響消費者的健康安全[1]。蛋白質氧化會導致蛋白質側鏈基團修飾，蛋白質大分子發生交聯聚集等，從而影響肉制品的色澤、保水性和口感[2]。近年來關于肌原纖維蛋白氧化凝膠特性的研究多集中在氧化劑種類、濃度、離子強度(食鹽、磷酸鹽含量)及不同的抗氧化劑等方面[3-6]。關于氧化的肌原纖維蛋白對熱誘導凝膠特性的研究機制還有待繼續探討[7-9]，凝膠水分分布與蛋白質氧化程度之間的關系需要深入研究。本試驗采用羥自由基模擬氧化體系對肌原纖維蛋白進行不同程度的氧化處理，研究氧化程度對蛋白活性巰基、疏水性、二聚酪氨酸以及內源色氨酸熒光強度等蛋白質理化特性的影響，采用低場核磁技術研究蛋白質氧化與凝膠水分分布之間的關系，為凝膠類肉制品的加工提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

豬背最長肌(小里脊)購自南京蘇果超市，本研究主要在南京農業大學國家肉品工程中心完成。KCl、MgCl2、EGTA、Na2HPO4、NaCl、NaOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉、FeCl3、抗壞血酸、H2O2、甘氨酸、EDTA、DTNB(5,5’-二硫雙(5’-硝基苯甲酸))、Trolox(水溶性維生素E)，以上試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。牛血清蛋白，購于沃卡威(北京)生物技術有限公司。

1.2 試驗儀器與設備

PQ001核磁共振分析儀，上海紐邁電子設備有限公司；RetschGM200絞肉機，IKA T25勻漿機，Avanti J-26S XP高速冷凍離心機，美國Beckman coulter；CR-400色差儀(日本柯尼卡美能達公司)，M2e多功能酶標儀(美國MD公司)，UV-2800A型紫外可見分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

參考PARK等[10]和FENG等[5]的方法并略作修改。在市場上購買最新鮮的豬背肌(小里脊)，用刀剔除豬肉上多余的筋膜、脂肪后，將豬肉切成均勻的小塊并用絞肉機攪碎，所得的肉糜用于接下來提取豬肉肌原纖維蛋白。稱取50 g肉樣，加4倍體積的pH 7.0緩沖液(0.1 mol/L KCl, 2 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Na2HPO4)勻漿離心，棄上清液，取沉淀重復上述步驟3遍。所得沉淀加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl洗液，勻漿離心，沉淀重復洗滌2次，第3次加洗液勻漿后，用4層紗布過濾以除去結締組織等，最后用0.1 mol/L HCl調pH值為6.25后離心除去上清液，所得膏狀物為肌原纖維蛋白。

1.3.2 羥自由基氧化體系的構建及氧化

參考XIONG等[11]的方法并修改。首先用20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)將豬肉肌原纖維蛋白溶解后，在溶解后的蛋白質溶液中依次加入無水FeCl3、抗壞血酸、H2O2溶液以用來構建羥自由基的模擬氧化體系，并且整個體系最終含有以下成分：20 mg/mL的豬肌原纖維蛋白、0.01 mmol/L的FeCl3和0.1 mmol/L的VC，其中的H2O2分為0、0.5、1、5、10 mmol/L 5個濃度梯度。在4 ℃恒溫操作間中氧化12個小時后，用1 mmol/L Trolox/EDTA來終止氧化反應，此即為氧化后的豬肉肌原纖維蛋白，貯藏于0～4 ℃，2 d內用完。

1.4 物理化學性能的測定

自由巰基和總巰基含量按照XIA等[12]的方法進行測定。疏水性測定采用溴酚藍結合法進行，參照CAO[4]描述的方法進行測定。二聚酪氨酸含量參考李學鵬等[13]的方法測定。內源色氨酸熒光的變化通過F4600熒光分光光度儀進行檢測。用 20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)將樣品稀釋為0.1 mg/mL。激發波長283 nm，記錄下300～400 nm的發射光譜。

1.5 熱誘導蛋白凝膠的制備及性能測定

將氧化后的豬肉肌原纖維蛋白調至40 mg/mL后，在80 ℃下水浴30 min，制得凝膠，用于測定其蒸煮得率、白度、保水性及凝膠水分分布分析。

1.5.1 蒸煮得率計算

將凝膠倒置于濾紙上，用濾紙吸干水分，稱量凝膠重量。蒸煮得率以蒸煮后的質量與蒸煮前的質量的比值計算。

1.5.2 凝膠白度測定

用色差儀測定蛋白凝膠的色差值，其中亮度值L*；紅度值a*；黃度值b*。儀器經零點白板校正后進行樣品測定，每組測定3次，取平均值。凝膠白度值按式(1)計算。

(1)

1.5.3 凝膠保水性測定

用離心法測定凝膠保水性(water holding capacity，WHC)，將制備好的蛋白凝膠準確稱其質量后，于 4 ℃下 6 000×g離心15 min，記錄離心前后離心管的質量以及空管質量。WHC按式(2)計算。

(2)

式中：m2為離心出液體后離心管與凝膠的質量，g；m1為離心前離心管與凝膠的質量，g；m為空管質量，g。

1.5.4 凝膠水分分布的測定

低場核磁數據測量參考HAN等[6]和JI等[14]的方法進行。測定條件：質子共振頻率為22.6 MHz，測量溫度為32 ℃。將大約1.0 g樣品放入直徑15 mm核磁管中，隨后立即放入PQ001核磁共振成像儀中進行分析。采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列測定樣品弛豫時間T2值。不同弛豫時間各峰峰面積分別記為P21，P22和P23。

1.6 統計分析

試驗重復進行3次，每次重新提取肌原纖維蛋白。用SPSS 18.0統計軟件進行單因素方差分析，Duncan’s多重比較和差異顯著性分析(P<0.05)。所有數據均為平均值±標準差。

2 結果與討論

2.1 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白中游離巰基含量的影響

氧化程度對肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響見圖1。游離巰基的含量隨H2O2濃度的升高而降低，對照組與其余各組之間差異顯著(P<0.05)。當H2O2濃度1 mmol/L時，游離巰基含量比對照組降低了9.6%，H2O2濃度為10 mmol/L時下降最明顯，下降了19.4%。這與前人的研究基本一致[15-16]，氧化導致肌原纖維蛋白的游離巰基轉變為二硫鍵及相關化合物，氧化同時引起蛋白質側鏈結構發生修飾，導致游離巰基含量減少。本課題組前期研究也發現添加抗氧化劑也未能阻止氧化引起的巰基減少[17]，其原因可能是蛋白質側鏈中巰基是最容易受到氧化攻擊的基團。

圖1 不同氧化程度對肌原纖維蛋白游離巰基含量的影響Fig.1 Effect of different oxidation degrees on the freesulfydryl of myofibrillar protein注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

氧化程度對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響見圖2。隨著H2O2濃度的升高，蛋白質表面疏水性逐漸增大。H2O2濃度0 mmol/L與0.5 mmol/L組差異不顯著(P<0.05)，這可以說明在較低的濃度進行氧化處理時，蛋白質的構象變化很小。繼續增大H2O2濃度，溴酚藍(BPB)結合量顯著增大，H2O2濃度為1 mmol/L 與5 mmol/L組差異顯著(P<0.05)。H2O2濃度5 mmol/L與10 mmol/L 組差異顯著(P<0.05)。其中，5 mmol/L組H2O2濃度比對照組增加了75.3%；而10 mmol/L組比對照組增加了103.6%。蛋白質氧化后，經過變性解折疊，就會很容易增強其表面疏水性，從而分子之間就會發生交聯和聚集等反應[11]。本研究中隨氧化劑濃度的升高，蛋白質表面疏水性增加，這說明蛋白質的構象在氧化劑處理下會發生比較顯著的變化，蛋白質分子的表面會暴露出更多的疏水氨基酸殘基，并且逐漸被氧化，此外，蛋白質的疏水性還與其他的許多因素有關，比如氨基酸之間會發生疏水相互作用以及氧化會導致的蛋白質間發生聚集和交聯等反應[18]。所以，蛋白質的側鏈發生氧化、去折疊和聚集等變化，從而三者之間的相互影響導致蛋白質的疏水性等性質發生改變。

圖2 不同氧化程度對肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.2 Effect of different oxidation degrees on the BPB content of myofibrillar protein

2.3 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響

肌原纖維蛋白酪氨酸殘基被氧化后就會形成二聚酪氨酸，并且會通過共價鍵和非共價鍵之間的相互作用形成蛋白質的聚集物，能夠反映蛋白質氧化的程度和蛋白質結構的變化。豬肉肌原纖維蛋白經羥自由基氧化處理之后，二聚酪氨酸的含量變化如圖3所示，隨著氧化劑濃度的增加，二聚酪氨酸相對熒光值增大，0.5、5和10 mmol/L組與對照組差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，5 mmol/L和10 mmol/L組分別增加了50%和57%，說明酪氨酸殘基對于·OH也比較敏感，易發生交聯反應進一步聚合而形成二聚酪氨酸。有研究采用2種自由基氧化大黃魚肌原纖維蛋白時均發現，隨氧化劑濃度的升高，二聚酪氨酸含量顯著增加，并且與對照組相比差異顯著[13]。而XIONG等[19]研究發現在3種氧化體系中，肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量與對照組沒有顯著差異，其測定的酪氨酸含量與其他食品中含量一致，認為二聚酪氨酸不是蛋白質氧化交聯的主要方式。出現不同的研究結果，可能與氧化劑的濃度以及氧化體系的差異引起的，將來有可能探討二聚酪氨酸新的測定方法，解決爭議問題。

圖3 不同氧化程度對肌原纖維蛋白二聚酪氨酸含量的影響Fig.3 Effect of different oxidation degrees on the dityrosine of myofibrillar protein

2.4 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度的影響

肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光強度見圖4，隨著H2O2濃度的逐漸升高，蛋白內源熒光強度顯著降低。內源熒光是用來表示蛋白質氧化程度和微環境的影響，進而揭示蛋白質的結構變化情況。

圖4 不同氧化程度對肌原纖維蛋白內源色氨酸熒光的影響Fig.4 Effect of different oxidation degrees on the tryptophan fluoescence of myofibrillar protein

對于蛋白質內源熒光強度下降的原因，我們認為一種可能是在蛋白質的氧化初期，由于色氨酸殘基發生了包埋而引起的，并且隨著時間的延長包埋的效率會逐漸越來越低，由此可知蛋白質的包埋程度會受到氧化劑濃度的影響，并且所受影響較大；另一種可能是氧化處理會使得蛋白質側鏈中的熒光氨基酸被猝滅等[20]。

2.5 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白凝膠蒸煮得率、白度、保水性的影響

氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白凝膠性能的影響見表1。蛋白質凝膠的蒸煮得率隨H2O2濃度的增加，凝膠蒸煮得率降低，各組之間顯著差異(P<0.05)。5 mmol/L H2O2組與對照組相比，凝膠蒸煮得率下降了24.16%，10 mmol/L組與對照組相比，凝膠蒸煮得率下降了22.4%，這可能是由于在較高濃度的氧化處理之下，就會破壞豬肉蛋白質結構，蛋白構象發生變化，部分水分析出，形成汁液流失，從而導致凝膠的蒸煮得率顯著降低[3]。

如表1所示，隨H2O2濃度的增加，白度值逐漸下降，10 mmol/L組與對照組顯著差異(P<0.05)，其余各組與對照組差異不顯著(P>0.05)。蛋白凝膠的白度可以體現蛋白質的變性程度，根據XIA等[21]的研究發現，蛋白凝膠白度值的下降，與氧化產物和蛋白質的氨基酸側鏈之間發生非酶褐變等的反應相關。本研究中，高濃度的H2O2，導致蛋白質氧化嚴重。

表1 氧化程度對肌原纖維蛋白凝膠蒸煮得率、白度及保水性的影響Table 1 Effect of different oxidation degrees on the boiling rate, whiteness and water holding capacity of myofibrillar protein

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

蛋白凝膠的保水性隨H2O2濃度的增加而降低，10 mmol/L組與其余各組差異顯著(P<0.05)。與對照組相比，當H2O2濃度增加到 10 mmol/L時，蛋白質凝膠保水性下降了16.47%(P<0.05)。蛋白質凝膠的保水性主要是由于蛋白質的水合作用和毛細管作用力，從而水分就會被束縛在蛋白質的凝膠網絡結構中。肌原纖維蛋白熱誘導凝膠有以下作用力：疏水作用力、氫鍵、靜電作用力、巰基氧化形成的二硫鍵等，需要經歷變性、聚集和交聯3個過程，任何影響這3個過程的因素都會影響蛋白質的熱誘導凝膠特性[10]。高濃度氧化劑導致肌原纖維蛋白交聯形成部分二硫鍵，蛋白質分子表面也會暴露出更多的疏水氨基酸殘基，疏水性氨基酸通過疏水相互作用形成不溶性聚集物，溶解度下降，使肌原纖維蛋白凝膠結構變得疏松，在凝膠結構中產生較多的空隙，水分流失，使得蛋白質的水合作用和毛細管作用力逐漸降低，并且蛋白質凝膠網絡中的空隙逐漸增多，讓蛋白質凝膠中一部分不易流動的水變成了自由水，所以凝膠保水性也變差[3]。

2.6 氧化程度對豬肉肌原纖維蛋白凝膠水分分布的影響

氧化程度對肌原纖維蛋白水分分布圖譜見圖5。

圖5 不同氧化程度對肌原纖維蛋白凝膠水分子的T2弛豫特性的影響Fig.5 Effect of different oxidation degrees on T2 relaxation time of myofibrillar protein

豬肉肌原纖維蛋白凝膠弛豫時間(T2)在1～10 000 ms 內出現了3個峰，這與韓敏義等[6]研究豬肉肌原纖維蛋白熱凝膠的試驗結果基本一致。T2值范圍內對應的3個峰分別對應凝膠中的3種狀態的水，弛豫時間T21在0～15 ms，屬于凝膠中的結合水，弛豫時間T22在63～382 ms，屬于凝膠中的不易流動水，弛豫時間T23在714～2 171 ms，屬于凝膠中的自由水。弛豫時間(T2)在1～10 000 ms對應的3個峰的峰面積分別記為P21,P22,P23。通過分析各峰的峰面積結果可以得知(如表2)，H2O2濃度對結合水含量P21影響不大(P>0.05)。結合水是肌原纖維蛋白凝膠中與蛋白質大分子結合的水分子，大部分研究結果表明，T21與肉的微觀結構及機械壓力無關[22-23]。不易流動的水P22隨H2O2濃度的增加而下降，其中H2O2濃度為5 mmol/L和10 mmol/L時與對照組差異顯著(P<0.05)，H2O2濃度為0.5 mmol/L和1 mmol/L 時與對照組差異不顯著(P>0.05)。自由水含量P23隨H2O2濃度的增加而增加，其中H2O2濃度為0.5 mmol/L 和1 mmol/L 時與對照組差異不顯著(P>0.05)， H2O2濃度為5 mmol/L和及10 mmol/L時與對照組差異顯著(P<0.05)，P23分別增加了54%和73%。上述分析表明，隨著H2O2濃度的升高，豬肉肌原纖維蛋白凝膠中的一部分不容易流動的水可能會變成自由水，但自由水是蛋白凝膠結構中結合最不緊密的水和最容易損失的水[24]。其他研究也發現，豬肉保水性與T2弛豫時間存在很強的相關性[25-26]。因此，H2O2濃度越大，不易流動的水含量越低，而自由水含量就越高，凝膠保水性越低，這與本試驗關于豬肉肌原纖維蛋白的凝膠保水性研究結果相一致。

表2 羥自由基氧化對豬肌原纖維蛋白熱誘導凝膠峰面積的影響Table 2 Effect of different oxidation degrees on thepeaks area proportion of myofibrillar protein

2.7 相關性分析

由相關性分析表明(見表3)，H2O2濃度與豬肌原纖維蛋白中游離巰基含量極顯著負相關(r=-0.931，P<0.01)，與疏水性值(r=0.963，P<0.01)和二聚酪氨酸含量(r=0.787，P<0.01)正相關，說明H2O2濃度越高，蛋白質側鏈基團越容易被氧化修飾，從而影響蛋白質的功能特性。H2O2濃度與凝膠蒸煮得率(r=-0.554，P<0.05)顯著負相關，及凝膠保水性(r=-0.904，P<0.01)極顯著負相關，說明H2O2濃度越高，凝膠的蒸煮得率、保水性越差。同時游離巰基含量與凝膠蒸煮得率顯著相關(r=0.597，P<0.05)，與凝膠保水性(r=0.888，P<0.01) 極顯著相關；疏水性與凝膠蒸煮得率極顯著負相關(r=-0.702，P<0.01)，與凝膠保水性(r=-0.790，P<0.01)極顯著負相關。這表明H2O2濃度越高，蛋白被氧化程度越嚴重，凝膠的蒸煮得率、保水性越差。

表3 各指標相關性分析Table 3 Correlation analysis between indexes of gels

注：*表示P<0.05 水平差異顯著；**表示P<0.01 水平差異極顯著。

3 結論

在羥自由基氧化體系中，隨著氧化劑濃度的增加，豬肉肌原纖維蛋白游離巰基含量、內源色氨酸熒光強度、蛋白質凝膠的蒸煮得率、白度和保水性以及低場核磁中不易流動水含量顯著下降，而二聚酪氨酸含量、表面疏水性和低場核磁中自由水含量增加。以上變化可以說明氧化處理使肌原纖維蛋白側鏈基團中的游離巰基、酪氨酸、色氨酸殘基發生顯著的氧化修飾，蛋白質分子之間彼此發生交聯和聚集等反應，蛋白質構象進一步發生顯著變化，進而影響其凝膠的保水性。