克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產物中ACE抑制肽的分離純化與鑒定

李銳，鄒茜，孫玉林，王林，馮明會，李想*

1(嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江，524048)2(四川旅游學院，四川 成都，610100) 3(云南省農業科學院糧食作物研究所，云南 昆明，650205)

據相關統計顯示，2017年全世界高血壓患病人數高達9.72億[1]。人體中機體血壓和體液平衡主要由腎素-血管緊張素-醛固酮系統來進行調節，而血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)在系統中起重要作用，它能夠調節人體鹽-水平衡和動脈血壓[2]。血管緊張素轉移酶抑制肽(ACE inhibitory peptides, ACE抑制肽) 是一類具有抑制血管緊張素轉換酶活性的多肽類物質[3]。ACE抑制劑通過抑制人體內ACE酶的活性，降低對舒緩激肽的破壞作用，從而減少血管緊張素Ⅱ的合成，達到控制血壓上升的目的[4-5]。目前，許多人工合成的ACE抑制劑雖然具有良好的降血壓療效(如福辛普利、西拉普利等)，但同時會使人體產生頭痛、咳嗽、眩暈、疲勞等負面作用[6-7]。食源性生物活性肽是以食源性蛋白質為原料制備的，具有低過敏性、安全、無毒等優點，近年來越來越受到人們的青睞。目前人們已用玉米[8]、魔芋[9]、帶魚脊骨[10]、泰和烏骨雞肉[11]、沙丁魚[12]及紅松仁[13]等制備得到了ACE抑制肽。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)，俗稱小龍蝦。2016年我國小龍蝦總產量達到89.91萬t，是全世界世界最大的小龍蝦生產國[14]?？耸显r在加工過程中有接近整蝦質量50%～ 80%的蝦頭、蝦殼被廢棄或者加工成飼料，造成嚴重的環境污染和資源浪費[15]。據研究，克氏原螯蝦蝦頭中粗蛋白含量為13.13%，同時含有豐富的脂類、蝦青素和生物活性物質，可以作為優良的蛋白質來源[16]。利用蛋白酶水解克氏原螯蝦蝦頭，其酶解產物中含有大量的短肽、氨基酸等物質。這些小分子肽具有各種生物活性，經過分離純化后得到具有特殊生物活性的功能肽，可作為功能食品應用于保健與預防醫學領域，具有廣闊的市場前景[17-20]。

目前，國內外利用克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產物制備ACE抑制肽的研究鮮見報道。本研究以克氏原螯蝦蝦頭為原料，通過模擬胃腸道消化制備酶解液。以ACE抑制率為指標，通過超濾、凝膠色譜、離子色譜、反向高效液相色譜對模擬胃腸道消化產物進行分離篩選，以期獲得具有較高ACE抑制活性的高純度單一肽，并對其結構進行解析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

克氏原螯蝦蝦頭，鮮活的克氏原螯蝦(Procamb-arusclarkia)購于四川省成都市青羊區麥德龍超市，洗凈瀝干水分后取蝦頭，分裝保存于-20 ℃備用。胃蛋白酶(酶活力1 200 U/g)和胰蛋白酶(酶活力50 000 U/g)，購于國藥集團化學試劑有限公司；胰凝乳蛋白酶(1 500 U/g)， 購于美國Sigma公司。

ACE、馬尿酰-組氨酰-亮氨(N-Hippuryl-His-Leu，HHL)，購于美國Sigma公司；馬尿酸，購自美國Sigma公司；葡聚糖凝膠(Sephadex G-25、Sephadex G-15)、陰離子交換樹脂Capto Q，購于美國GE公司；福林-酚試劑，購自北京鼎國生物科技有限公司；乙腈(色譜純)，其他試劑均為國產分析純。

真空冷凍干燥機FDU-1100，日本東京理化器械株式會社；LTQ Orbitrap Elite質譜儀，美國Thermo Fisher公司；高效液相色譜儀LC1200，美國Agilent公司；Mini Pellicon超濾系統，德國Merck Millipore有限公司；WTM-CM-01陶瓷膜分離設備，杭州沃騰膜有限公司；高速冷凍離心機HF-2100R，美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產物的制備

技術路線：

克氏原螯蝦蝦頭→前處理→絞碎均質→滅酶→模擬胃消化→模擬腸道消化→200目濾布過濾→0.2 μm陶瓷膜過濾→-10 ℃保存備用

模擬胃腸道消化參考JOHNS等[23]的方法，稍作改動。原料預處理：取冷凍的克氏原螯蝦蝦頭置于4 ℃解凍，絞碎后添加適量蒸餾水(質量比1∶2)，用高速均質機均質5 min(轉速5 000 r/min)，于80 ℃的水浴中充分加熱20 min，使蝦頭內源酶失活。體外模擬胃消化：用1 mol/L的HCl溶液將勻漿液pH值調到2.0，按m(酶)∶m(底物)=1∶50添加胃蛋白酶，混勻后于37 ℃下攪拌反應2 h，反應結束后，置于90～100 ℃的水浴中加熱10 min，使胃蛋白酶失活。體外模擬腸道消化：用1 mol/L的NaOH溶液將酶解液pH值調到7.5，按復合酶添加量(m(胰蛋白酶)∶m(胰凝乳蛋白酶)=6∶1)，底物質量比為1∶25的比例添加復合酶，混勻后于37 ℃下攪拌反應4 h，反應結束后，置于80 ℃的水浴中充分加熱20 min，使胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶失活。之后將酶解液用200目的濾布通過三足離心機過濾，可除去大部分固體顆粒，再用陶瓷膜(孔徑0.2 μm)過濾，得到的濾液即為克氏原螯蝦蝦頭模擬腸胃道消化產物(SGDP)，放置于-10 ℃保存備用。

分別在模擬消化過程 10、30、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360、390 min取樣；于80 ℃加熱20 min終止反應；于4 500 r/min離心10 min，取上清液調節pH值至5.0；于4 500 r/min離心30 min去除大分子蛋白，得到樣品液。

1.2.2 ACE抑制活性的測定

馬尿酸標準的測定參考朱國萍等[24]的方法。

ACE抑制活性的測定參考王晶晶等[12]的方法，稍作改動。未加樣品組：取5 mL離心管依次加入50 μL超純水和50 μL HHL溶液，37 ℃溫浴20 min，再加入50 μL ACE于37 ℃溫浴20 min，加入150 μL 1 mol/L HCl終止反應。樣品組：取5mL離心管依次加入50 μL 樣品溶液和50 μL HHL溶液，37 ℃溫浴20 min， 再加入50 μL ACE于37 ℃溫浴20 min，加入150 μL 1 mol/L HCl終止反應。高效液相色譜測定條件：Waters C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5μm)；檢測波長為228 nm；流速為1 mL/min；流動相A：超純水(含0.05%三氟乙酸,V/V)；流動相B：乙腈(含有0.05%三氟乙酸,V/V)；進樣量：10 μL；柱溫: 25 ℃； 洗脫條件：V(B)∶V(A)=25%∶75%。ACE抑制率的公式如式(1)：

(1)

式中:A，未加入樣品組中馬尿酸的峰面積，mAU·s；B，加入樣品組中馬尿酸的峰面積，mAU·s；其中ACE抑制率為 50%時ACE的濃度即為半數抑制濃度(mg/mL)，記為IC50。

1.2.3 水解度測定

氨基態氮含量的測定參考NILSANG等[25]的方法。取1 mL的樣品溶液和2 mL的去離子水加入250 mL的錐形瓶，再加入10 mL去離子水，用0.05 mol/L的NaOH溶液將pH調到7.0，再加入4 mL體積分數18%的甲醛溶液，混勻后用0.05mol/L的NaOH溶液將pH滴定至9.5，記錄滴定消耗的NaOH溶液體積，計算樣品中氨基態氮的含量，記為A；原料總氮和非蛋白氮含量采用微量凱氏定氮法測定。

水解度(degree of hydrolysis, DH)按公式(2)計算:

(2)

式中：A，樣品中總氮量；B，樣品中的氨基氮量；C，樣品中游離的氨基氮量；D，樣品中的非蛋白氮量。

1.2.4 分子質量測定

分子質量測定參考劉建華等[11]的方法。

1.2.5 超濾分離

取克氏原螯蝦模擬腸胃道消化產物，置于-4 ℃解凍，在溫度為25 ℃、壓力為40 Psi、流速為0．5 m/s的條件下分別用8 000 u、5 000 u和3 000 u的超濾膜超濾，得到4個不同組分，分別為C1 (MW> 8 000 u)、C2(5 000 u

1.2.6 Sephadex G-25凝膠層析分離

將超濾組分用Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析柱(l.6 cm×40 cm)進行層析分離。分離條件為：以超純水(過0.45 μm濾膜)作為洗脫液，上樣濃度為5 mg/mL， 檢測波長為220 nm，流速為 1 mL/min，上樣體積為2 mL。收集各組分洗脫液冷凍干燥并測定ACE抑制活性。

1.2.7 Capto Q離子交換層析分離

取上一步分離得到ACE抑制活性最高的組分，用Capto Q離子交換柱(2.6 cm×12 cm)進行分離。分離條件為：緩沖液為0.05 mol/mL Tris-HCl溶液(pH 9.5)，洗脫液為0.5 mol/mL NaCl溶液，上樣體積為10 mL，流速為0.5 mL/min，上樣濃度為2 mg/mL，檢測波長為220 nm。收集各組分洗脫液冷凍干燥并測定ACE抑制活性。

1.2.8 Sephadex G-15凝膠層析分離

取上一步分離得到ACE抑制活性最高的組分，用Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析柱(1.6 cm×70 cm) 進行分離。分離條件為：以超純水(過0.45 μm濾膜)作為洗脫液，上樣濃度為5 mg/mL，檢測波長為220 nm，流速為0.5 mL/min，上樣體積為2 mL。收集各組分洗脫液冷凍干燥并測定ACE抑制活性。

1.2.9 RP-HPLC分離

取上一步分離得到ACE抑制活性最高的組分，使用YMC-Pack ODS-AQ C18色譜柱(4.0 mm× 250 mm, 5 μm)進行RP-HPLC純化。分離條件為：流動相A為乙腈，流動相B為超純水(過0.45 μm濾膜)，梯度洗脫程序：0～60 min，乙腈濃度按直線斜率從0%升到60%；上樣濃度為5 mg/mL，檢測波長為220 nm，流速為1.0 mL/min，上樣體積為2 mL。

1.2.10 氨基酸序列鑒定

RP-HPLC分離后得到1個ACE抑制活性較高的組分，使用Thermo LTQ Orbitrap Elite質譜儀進行ESI MS/MS質譜測定其氨基酸序列。樣品前處理：將樣品冷凍干燥后制成干粉，用超純水復溶后過0.45 μm濾膜，然后上樣。測定條件：上樣濃度為300 μg/mL，源加熱溫度為200 ℃，鞘氣流速為8 L/min，輔助氣流速為2.5 L/min， 噴霧電壓為+3.0 kV，毛細管溫度為300 ℃。

1.2.11 數據處理

實驗結果用平均值±標準偏差表示(n=3)，使用Origin 8.0和SPSS 22.0 軟件進行作圖和數據分析。

2 結果與討論

2.1 不同階段消化產物的水解度和ACE抑制活性

圖l為克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產物不同階段的水解度和ACE抑制活性。在體外模擬胃消化的階段中，10～120 min，消化產物的水解度從4.72% 快速上升到13.16%，而其ACE抑制率從10 min 的49.63%緩慢上升到69.73%。由此可知，在體外模擬胃消化的過程中，蝦頭中的蛋白質在胃蛋白酶的作用下，發生水解，其水解度逐漸增大。

圖1 克氏原螯蝦蝦頭模擬消化過程中酶解產物水解度及ACE抑制活性的變化Fig.1 Change of DH and ACE inhibitory activity of the enzymatic hydrolysis products during the simulated digestion of Procambarus clarkia head

同時，由于胃蛋白酶在蝦頭蛋白上存在特殊作用位點，產生了一部分具有對胃蛋白酶有耐受性，且具有較高ACE抑制活性的多肽，使得消化產物總體的ACE抑制活性緩慢上升。消化產物在模擬腸道消化過程中，120～180 min，消化產物的水解度急劇升高，從13.16%上升到30.98%。這個結果說明，在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的作用下，大量蝦頭蛋白被水解，生成小分子肽類物質。210～390 min，消化產物的水解度變化不大，增加趨勢變緩，原因可能是蝦頭蛋白水解基本完成，并且胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶經過長時間作用，其酶活有所降低[22]。消化產物的ACE抑制活性在進入模擬腸道的消化環境后，開始快速下降，ACE抑制率從120 min的69.73%下降到210 min的54.69%。240～390 min，消化產物的ACE抑制率保持在52.96%～55.43%，整體變化不大。消化產物的小分子肽在模擬胃消化的環境中，對胃蛋白酶的耐受性較強，但對胰酶具有較弱的耐受能力，當進入模擬腸道消化的環境時，部分肽鍵在胰酶的作用下被切斷，導致其ACE抑制活性下降[11,21]。而在240 min后，ACE抑制活性變化不大，說明殘留的活性肽在腸道環境中對胰酶具有較強的耐受性，其ACE抑制活性趨于穩定。消化產物在反應結束時，其ACE抑制率為55.43%，此時消化產物一般位于小腸部位，這些小分子肽容易被小腸的上皮細胞吸收到機體內，可以在體內發揮ACE抑制活性?？耸显r蝦頭模擬消化不同階段ACE抑制活性的變化規律，與劉建華等[11]報道泰和烏骨雞肉模擬消化產物ACE抑制活性的結果接近。

2.2 克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產物的超濾分離

通過超濾系統用3 000、5 000和8 000 u的濾膜對克氏原螯蝦蝦頭模擬消化產物進行超濾分級分離，收集透過液和截留液，測定各組分的半數抑制濃度濃度IC50值。結果如圖2所示。

圖2 模擬消化產物超濾組分的ACE抑制活性Fig.2 ACE inhibitory activity of the ultrafiltration fractions of products under the simulated digestion

測定模擬消化產物(SGDP)和4個超濾組分的ACE抑制活性，其中組分C4(MW<3 000 u)的ACE抑制活性最高，IC50值為0.97 mg/mL。通過超濾膜分離，模擬消化產物ACE抑制活性的IC50值從1.84 mg/mL(SGDP)下降到0.97 mg/mL(組分C4)，純化倍數為1.89倍。

采用高效液相空間排阻法，對ACE抑制活性最高的組分C4分子質量分布進行測定(表1)。組分C4中分子質量分布顯示，分子質量在3 000 u以下占67.74%， 其分子質量主要在3 000～2 000 u，占31.28%，數均分子質量和重均分子質量分別為2 286.19 u和2 311.80 u。組分C4的數均分子質量和重均分子質量分別為2 804.55 u和1 894.30 u。研究發現，不同來源的活性肽分子質量各不相同，而同種來源的活性肽在不同的分子質量也會表現出不同的生物活性。國內外的研究學者發現，ACE抑制活性較高的肽類主要集中在3 000 u以下。朱國萍等[24]報道，用蝦頭制備自溶產物，其3 000 u超濾組分的ACE抑制活性最高。苗欣宇等[13]采用超濾對松仁清蛋白酶解液進行分離，得到3個組分(A1<3 000 u、 A2 3 000～10 000 u和A3>10 000 u)，A1組分的ACE抑制率和比活力均高于其他組分。綜上，選擇組分C4進行Sephadex G-25凝膠層析分離。

表1 組分C4的分子質量分布Table 1 Distribution of peptide molecular weight of fraction C4

2.3 Sephadex G-25凝膠層析分離

利用Sephadex G-25凝膠層析對組分C4進行分離純化，得到5個組分，分別命名為C4-1、C4-2、C4-3、C4-4和C4-5(圖3)。

圖3 組分C4的Sephadex G-25分離圖譜Fig.3 Chromatogram of fraction C4 separated on Sephadex G-25

將各組分冷凍干燥，取干粉用超純水溶解，測定各個組分的半數抑制濃度濃度IC50值(圖4)。其中組分C4-2的ACE抑制活性最高，IC50值為0.42 mg/mL，與蝦頭模擬消化產物相比，純化倍數為4.38倍。因此，選擇組分C4-2進行下一步的分離純化。

圖4 Sephadex G-25分離組分的ACE抑制活性Fig.4 ACE inhibitory activity of fractions separated on Sephadex G-25

2.4 Capto Q離子交換層析分離

如圖5所示，利用Capto Q離子交換層析對組分C4-2進行分離純化，得到5個組分，分別命名為C4-2-1、C4-2-2、C4-2-3、C4-2-4和C4-2-5。將各組分冷凍干燥，取干粉用超純水溶解，測定各個組分的半數抑制濃度濃度IC50值(圖6)，其中組分C4-2-5的ACE抑制率最高，IC50值為0.29 mg/mL，與蝦頭模擬消化產物相比，純化倍數為6.34倍。因此，選擇組分C4-2-5進行下一步的分離純化。

圖5 組分C4-2的Capto Q離子交換層析分離圖譜Fig.5 Chromatogram of fraction C4-2 separated on Capto Q

圖6 Capto Q離子交換層析分離組分的ACE抑制活性Fig.6 ACE inhibitory activity of fractions separated on Capto Q

2.5 Sephadex G-15凝膠層析分離

利用Sephadex G-15凝膠層析對組分C4-2-5進行分離純化，得到3個組分，分別命名為C4-2-5-1、C4-2-5-2和C4-2-5-3(圖7)。測定各個組分的半數抑制濃度濃度IC50值(圖8)，其中組分C4-2-5的ACE抑制率最高，IC50值為0.18 mg/mL，與蝦頭模擬消化產物相比，純化倍數為10.22倍。經過Sephadex G-15凝膠層析分離，組分的ACE抑制活性得到大幅度提升，選擇組分C4-2-5-2進行下一步的分離純化。

圖7 組分C4-2-5的Sephadex G-15分離圖譜Fig.7 Chromatogram of fraction C4-2-5 separated on Sephadex G-15

圖8 Sephadex G-15分離組分的ACE抑制活性Fig.8 ACE inhibitory activity of fractions separated on Sephadex G-15

2.6 RP-HPLC分離

組分C4-2-5-2經RP-HPLC分離后得到的色譜圖如圖9所示。

圖9 組分C4-2-5-2的RP-HPLC分離圖譜Fig.9 Chromatogram of fraction C4-2-5-2 separated on RP-HPLC

由于雜峰較多，選擇收集2個主要組分峰，分別命名為C4-2-5-2-1和C4-2-5-2-2，并測定2個組分的半數抑制濃度濃度IC50值(圖10)，組分C4-2-5-2-1的ACE抑制率最高，IC50值為0.11 mg/mL，組分C4-2-5-2-2的ACE抑制活性稍低，為0.14 mg/mL。對2個組分進行RP-HPLC驗證(圖11)，組分C4-2-5-2-1雜峰較少，成分單一；而組分C4-2-5-2-2的RP-HPLC圖譜還有較多的雜峰，成分復雜，因此選擇組分C4-2-5-2-1作為單一組分的ACE抑制肽。

圖10 RP-HPLC分離組分的ACE抑制活性Fig.10 ACE inhibitory activity of fractions separated on RP-HPLC

A-組分C4-2-5-2-1;B-C4-2-5-2-2 圖11 組分C4-2-5-2-1和C4-2-5-2-2的RP-HPLC分離圖譜Fig.11 Chromagram of fraction C4-2-5-2-1 and C4-2-5-2-2 separated on RP-HPLC

研究表明，高純度的ACE抑制肽通常采用多種分離方法相結合的方式來進行制備。苗欣宇等[12]采用超濾、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色譜對松仁清蛋白酶解液進行分離純化，獲得1個ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys。陳小藝等[26]以鮑魚內臟多肽酶解液為研究對象，通過超濾、DEAE-52纖維素陰離子交換層析和葡聚糖G-25凝膠層析對其進行分離純化，最終得到1個膠原ACE抑制肽。朱國萍等[24]從蝦頭自溶產物中分離純化得到2條ACE抑制肽(Tyr-Pro和Leu-Pro/Ile-Pro)，依次經過超濾、Sephadex G-25 葡聚糖凝膠層析、SP Sephadex C-25離子交換層析及Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析純化，ACE抑制活性提高將近8倍?？耸显r蝦頭模擬胃腸道消化產物的半抑制濃度IC50值為1.84 mg/mL，依次經過超濾、Sephadex G-25凝膠層析、Capto Q離子交換層析、Sephadex G-15凝膠層析、RP-HPLC，IC50值降到0.11 mg/mL，ACE抑制肽的IC50值純化了16.72倍(表2)。因此，將組分C4-2-5-2-1作為分離純化的克氏原螯蝦蝦頭模擬消化產物ACE抑制肽終產物，并對其肽序列進行研究。

表2 模擬消化產物中ACE抑制肽的純化情況表Table 2 Purification of ACE inhibitory peptide derived from products under the simulated digestion

2.7 氨基酸序列鑒定

采用電噴霧靜電場離子阱串聯質譜(LTQ Orbitrap ESI MS/MS)對組分C4-2-5-2-1的結構進行分析，將分析結果輸入PEAKS 7.0 軟件通過從頭測序法來分析多肽的氨基酸序列[27]。組分C4-2-5-2-1經一級質譜碎裂獲得較多的離子片斷，從眾多離子片斷中選擇信號較強、分子質量為235.4 u的離子片斷進行二級電離(圖12、圖13)。根據ACE抑制肽二級結構的圖譜，通過PEAKS軟件的分析推測出b離子碎片和y離子碎片斷裂的方式(表3)。對照表3和圖13可知，b1=112.2，y1=185.1和離子片段Pro-Val相吻合，因此組分C4-2-5-2-1的氨基酸序列為脯氨酸-纈氨酸(Pro-Val)，分子質量為225 u。

研究發現，ACE抑制肽一般是由2～12氨基酸殘基組成，大部分為分子質量較小的短肽，其中二肽和三肽居多[28]。KLEEKAYAI等[29]從泰國傳統發酵蝦膏中分離得到一個ACE抑制肽，其氨基酸序列為Ser-Val。王晶晶等[12]從遠東擬沙丁魚酶解產物中分離出具有較高活性的六肽Lys-Val-Glu-Pro-Leu-Pro和三肽Pro-Ala-Leu，它們的IC50值分別為22.9 μmol/L和12.2 μmol/L。YAMADA等[30]從牛乳酪蛋白水解液中得到一個新型αs2-酪蛋白源新型三肽MKP，其IC50值為0.12 μg/mL。另外，ACE抑制肽的活性也與氨基酸組成由很大的關系。SUETSUNA等[31]對15種魚蝦貝不同來源的ACE抑制肽的結構進行分析，結果發現，貝類ACE抑制肽氨基酸組成多為Asp、Lys和Glu，而魚類ACE抑制肽氨基酸組成多為Glu、Ile、Asp和Lys。但迄今為止，ACE抑制肽作用機制與結構的關系尚不明確。有研究學者指出，活性肽的C-末端氨基酸殘基為芳香族氨基酸殘基(Tyr、Trp、Phe)或Pro，N-末端為Pro或疏水性氨基酸殘基(Ile、Val、Leu)時，能與ACE產生強烈的結合作用，表現出顯著的ACE抑制活性，而C-末端殘基在ACE競爭性結合位點上占主導地位[32-33]。組分C4-2-5-2-1的氨基酸序列為脯氨酸-纈氨酸(Pro-Val)，其C-末端氨基酸殘基為Pro，該結構與前人的研究結果相一致。

表3 組分C4-2-5-2-1可能的幾種序列及其b離子與y離子的理論值Table 3 The theory value for b and y ion and the possible sequence of fraction C4-2-5-2-1

圖12 組分C4-2-5-2-1的一級質譜圖Fig.12 The primary mass spectrogram of fraction C4-2-5-2-1

圖13 組分C4-2-5-2-1的二級質譜圖Fig.13 Tandem mass spectrum of fraction C4-2-5-2-1

3 結論

克氏原螯蝦蝦頭通過模擬腸胃道消化進行酶解，消化產物中的ACE抑制肽主要分布在分子質量低于3 000 u 的超濾組分中；通過凝膠色譜、離子色譜、反向高效液相色譜相結合的方法對分子質量小于3 000 u的超濾組分進行分離純化與篩選，獲得了1個新型ACE抑制肽，該活性肽分子質量為225 u，肽序列為Pro-Val；IC50值為0.11 mg/mL，與模擬消化產物相比，IC50值純化了16.72倍。

本實驗研究結果為克氏原螯蝦蝦頭的開發和高附加值利用提供理論依據，同時也可為食源性降血壓肽的開發提供研究基礎。但本實驗僅系統研究了克氏原螯蝦蝦頭模擬胃腸道消化產物ACE抑制肽的分離純化條件，以及利用質譜鑒定其序列，下一步的工作將人工合成肽與分離的肽相對比，來進一步驗證肽序列的準確性，并通過細胞實驗和動物學實驗來評價降血壓功效，