三相萃取體系分離富集螺旋藻多糖及其結(jié)構(gòu)特征分析

羅光宏，馬明輝，張喜峰*，楊生輝，王丹霞，陳天仁

1(河西學(xué)院，甘肅省微藻技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 張掖，734000) 2(甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖，734000) 3(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖，734000)

螺旋藻(Spriulinaplatensis)是拉丁美洲和非洲國家的一種傳統(tǒng)食品。許多研究表明螺旋藻或其提取物能提高人體細(xì)胞免疫和體液免疫功能[1-2]，對人類或其它動物具有抑癌作用[3-4]。從螺旋藻中提取的螺旋藻多糖，具有抗氧化、抗病毒、免疫活性、抗炎和DNA修復(fù)等多種生物學(xué)活性[5-6]。螺旋藻多糖可提高機(jī)體SOD的活力，提高酶促防御能力，消除自由基，改善活性氧產(chǎn)生的傷害；抗病毒作用機(jī)理通過阻斷病毒向宿主細(xì)胞吸附，抑制感染細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制過程；抗疲勞作用主要通過減少蛋白質(zhì)和其他含氮化合物的分解代謝，降低血清尿素氮的形成，提高肝糖原和肌糖原貯備能力，明顯延長小鼠游泳運(yùn)動耐力時間，起到抗疲勞作用；螺旋藻多糖構(gòu)效關(guān)系主要體現(xiàn)在其一級結(jié)構(gòu)和其生物學(xué)活性，如螺旋藻多糖相對分子質(zhì)量、硫酸化等化學(xué)修飾、支鏈分支度結(jié)構(gòu)改變，均對其生物學(xué)活性產(chǎn)生影響；如相對分子質(zhì)量為1 000萬螺旋藻多糖比臨床多糖制劑激活體外單核細(xì)胞能力較強(qiáng)；螺旋藻多糖經(jīng)硫酸化修飾后，具有更強(qiáng)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖獲活性等[7]；螺旋藻多糖是一種水溶性多糖，可通過熱水浸提、沉淀、去蛋白和各種sephadex、sephacryl和sepharose柱層析方法等一系列步驟進(jìn)行純化[8]。但是上述分離方法具有處理量大、得率較低、大量有機(jī)溶劑消耗和成本較高等缺點或局限性。此外，TCA(tricarboxylic acid cycle)法、酶解法和Sevage法包括化學(xué)試劑和復(fù)雜純化過程，已成為多糖中去除蛋白質(zhì)的普遍方法[9-10]。

與傳統(tǒng)方法相比，三相萃取技術(shù)是一種新興的簡單、快速、高效、成本較低，非色譜分離技術(shù)[11]。三相萃取通常由一定量的無機(jī)鹽(如(NH4)2SO4)、含有蛋白質(zhì)的粗提取液和一定量的有機(jī)溶劑(如叔丁醇)混合組成[12]。色素、脂類、抑制劑和疏水化合物富集在上相即叔丁醇相，中間相主要為富集的蛋白質(zhì)或酶，而糖和其他親水性物質(zhì)都集中在下層水相即硫酸銨相。上述三相的形成主要與鹽的離子強(qiáng)度、kosmotropy、表面張力增強(qiáng)、滲透應(yīng)力有關(guān)[13]。由于其溫和液相環(huán)境在分離和純化生物活性物質(zhì)方面具有舉足輕重作用。近年來，三相萃取已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、抗氧化物、油脂、金屬回收等成分的分離和純化[14-17]。

本試驗采用三相萃取技術(shù)分離純化螺旋藻多糖，分別研究(NH4)2SO4濃度、叔丁醇加入量、pH、萃取溫度、時間對螺旋藻多糖得率的影響，并對其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，以期為螺旋藻多糖深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

螺旋藻，由甘肅省微藻創(chuàng)新技術(shù)中心提供；(NH4)2SO4、叔丁醇、苯酚、濃H2SO4、葡萄糖，均為分析純；透析袋(分子截留量8～12 kDa)，成都德思特生物技術(shù)有限公司。

PL-203 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；紫外可見分光光度計，上海譜元儀器有限公司；TG/DTA系列熱重差熱綜合熱分析儀，寧波賽茵儀器有限公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，江蘇天瑞儀器股份有限公司；高溫凝膠滲透色譜儀，北京億路達(dá)機(jī)電設(shè)備有限公司；FEI Quanta 450 FEG場發(fā)射掃描電鏡，F(xiàn)EI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 螺旋藻多糖粗提液制備

準(zhǔn)確稱取10 g螺旋藻粉末，按照固液比1∶0.045(g∶L)加入蒸餾水，在90 ℃水浴處理120 min后，5 000 r/min離心10 min后，上清液為螺旋藻多糖的粗提液[4]。

1.2.2 三相萃取螺旋藻多糖

取1.2.1制備的螺旋藻多糖粗提液10 mL，加入一定量的(NH4)2SO4使其終質(zhì)量濃度為100～600 g/L，采用HCl或NaOH調(diào)節(jié)其體系pH為5～9，再加入一定體積的叔丁醇(5～30 mL)，充分混勻后，在20～40 ℃ 水浴處理15～90 min，然后在3 000 r/min離心處理10 min，叔丁醇相可通過減壓蒸發(fā)回收叔丁醇；收集含多糖和硫酸銨的下相，記錄其體積，采用蒸餾水透析除鹽后，濃縮干燥得到螺旋藻多糖。

1.2.3 多糖得率測定及計算

多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，以100 μg/mL葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.113x+0.011 5(R2=0. 996 4)。其中y為490 nm 處的吸光度，x為葡萄糖的質(zhì)量濃度(μg/mL)。

(1)

其中：CL和VL分別為三相萃取平衡后下相中螺旋藻多糖質(zhì)量濃度和體積；M為螺旋藻粉末質(zhì)量。

1.2.4 多糖含量測定及計算

將1.2.2制備的多糖加入一定體積蒸餾水，充分混勻后，測定多糖濃度，按式(2)計算多糖含量。

(2)

其中：P0和V0分別為溶解后多糖溶液質(zhì)量濃度和體積，M0為制備的螺旋藻多糖。

1.2.5 與傳統(tǒng)多糖純化方法的比較

1.2.5.1 堿液冷提法

參考李會端和秦志玉之法[18]，按照料液比1∶0.025(g∶L)比例加入濃度為0.4 mol/L NaOH，浸提2 h后，在4 000 r/min離心10 min，取上清液加入5% 的三氯乙酸溶液脫蛋白，采用95%醇沉后，按照1.2.2和1.2.3方法測定多糖得率和含量。

參考賁永光等的方法[19]，按照固液比1∶0.025 (g∶L)，在溫度為50 ℃，超聲功率320 W，提取50 min條件下，離心后取上清液，濃縮后醇沉，并采用丙酮洗滌后，按照1.2.2和1.2.3方法測定多糖得率和含量。

1.2.5.3 傳統(tǒng)回流提取法

參照張文雄等的方法[20]，以固液比1∶0.015(g∶L)，在溫度為60 ℃，超聲功率320 W，提取4 h，醇沉，透析處理后，按照1.2.2和1.2.3方法測定多糖得率和含量。

1.2.5.4 酶解結(jié)合超聲波提取法

參照王以斌等的方法[21]，以固液比1∶0.016(g∶L)，在溫度為60 ℃，超聲功率200 W，加入復(fù)合酶，提取時間15 min，經(jīng)離心醇沉后，按照1.2.2和1.2.3方法測定多糖得率和含量。

1.2.6 螺旋藻多糖理化性質(zhì)

1.2.6.1 螺旋藻多糖紫外-可見波長掃描

本實驗是微組織（微載體復(fù)合脂肪干細(xì)胞的3D培養(yǎng)）對周圍神經(jīng)再生的體外研究。利用SD乳鼠脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)后與多孔明膠微載體材料復(fù)合構(gòu)建微組織，培養(yǎng)3 d后的微組織與背根神經(jīng)節(jié)共培養(yǎng)，觀察其對背根神經(jīng)節(jié)軸突生長的促進(jìn)作用，并與2D細(xì)胞共培養(yǎng)以及單純背根神經(jīng)節(jié)比較，并從細(xì)胞增殖和凋亡等方面分析比較2D、3D細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)劣勢。

配制1 mg/mL螺旋藻多糖溶液，在190～400 nm進(jìn)行掃描，檢測其是否含有蛋白質(zhì)和核酸。

1.2.6.2 螺旋藻多糖紅外光譜檢測

將冷凍干燥后螺旋藻多糖進(jìn)行溴化鉀壓片處理，在4 000～500 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描，分析其官能團(tuán)組成。

1.2.6.3 螺旋藻單糖組成檢測

參照范嘉龍等的方法[22]，對螺旋藻單糖進(jìn)行酸水解及衍生化處理后，采用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)分析其單糖組成及比例。

1.2.6.4 螺旋藻多糖分子質(zhì)量測定

采用體積排阻色譜-光散射聯(lián)用(size-exclusion chromatography combined with laser light scattering，SEC-LLS)進(jìn)行測定。多角度激光光散射儀λ=690 nm，校準(zhǔn)常數(shù)=8.850 0e-6；色譜柱型號為7.8 mm×300 mm； 溶劑為水。

1.2.6.5 螺旋藻多糖掃描電鏡觀察

采用Quanta 450場發(fā)射掃描電子顯微鏡對冷凍干燥后多糖樣品噴金處理后，觀察其表面結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理

以O(shè)rgin 8.0作圖，所用實驗均重復(fù)3次，采用Mean±SD表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 三相法分離富集螺旋藻多糖

2.1.1 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對螺旋藻多糖得率的影響

圖1 不同影響因素(硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、叔丁醇加入量、pH、萃取溫度、萃取時間)對螺旋藻多糖得率的影響Fig.1 Effect of mass fraction of (NH4)2SO4, amount of t-butanol, pH， temperature, and extraction time on the yield of PSP

2.1.2 叔丁醇加入量對螺旋藻多糖得率的影響

與其他醇類溶劑相比，叔丁醇是一種獨特一元醇，除具有溶解非極性成分外，還有醇沉和浮選劑作用，因此，叔丁醇的加入量對螺旋藻多糖得率的影響如圖1-b所示。隨著叔丁醇加入量逐漸增加，當(dāng)叔丁醇加入量為15 mL時，螺旋藻多糖得率為8.52%。原因可能是隨著叔丁醇加入量增加和硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸減小所呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)增強(qiáng)，表明叔丁醇作為一種kosmotrope試劑，對硫酸根增強(qiáng)效應(yīng)具有重要作用，少量叔丁醇對硫酸銨協(xié)同效應(yīng)較弱[24]；大量叔丁醇加入會導(dǎo)致下相中多糖含量減少，促使叔丁醇和硫酸根共同競爭水分子，導(dǎo)致得率下降。因此，確定叔丁醇加入量為15 mL。

2.1.3 體系pH對螺旋藻多糖得率的影響

固定硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，采用HCl或NaOH調(diào)節(jié)體系pH分別為5、6、7、8、9，加入叔丁醇15 mL，在25 ℃水浴60 min后，收集下相體積，計算多糖得率。結(jié)果如圖1-c所示。當(dāng)體系pH為7時，有利于螺旋藻多糖從三相中分離和富集，多糖得率最高為8.79%；原因可能pH影響生物大分子如蛋白質(zhì)解離或其表面電荷。此結(jié)果與劉楊[25]的研究結(jié)論是一致的，因此，確定三相體系pH為7。

2.1.4 萃取溫度對螺旋藻多糖得率的影響

固定硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，調(diào)節(jié)體系pH為7，加入15 mL叔丁醇，分別在20、25、30、35、40 ℃水浴處理60 min后，收集下相體積，計算多糖得率。結(jié)果如圖1-d所示，在20～35 ℃，多糖得率逐漸升高，此結(jié)論與DENNISON等[26]研究結(jié)果一致，即溫度升高后，有利于多糖分子羥基基團(tuán)的暴露，利于氫鍵網(wǎng)絡(luò)的形成，并促使其親水性增強(qiáng)，在下相中多糖含量增加，得率升高；當(dāng)溫度超過35 ℃后，高溫所需能耗增加。因此，本試驗確定萃取溫度為35 ℃。

2.1.5 萃取時間對螺旋藻多糖得率的影響

萃取時間不僅影響目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量和得率，且影響整個生產(chǎn)成本。因此，研究萃取時間對螺旋藻多糖得率的影響。由圖1-e可知，萃取時間對螺旋藻多糖得率影響不顯著，當(dāng)萃取時間為30 min后，萃取時間繼續(xù)增加，螺旋藻多糖得率變化無顯著差異。因此，確定萃取時間為30 min。

2.2 三相萃取螺旋藻多糖與傳統(tǒng)提取方法的比較

不同方法提取螺旋藻多糖得率和純度如表1所示。

表1 不同方法提取螺旋藻多糖得率和純度的比較研究Table 1 Comparison of yield and purity of polysaccharide from Spirulina platensis by different methods

由表1可知，采用三相萃取螺旋藻多糖方法與傳統(tǒng)方法提取相比，該法制備的多糖具有較高的得率和含量，具有分離和富集多糖的作用；采用三相萃取后，目標(biāo)產(chǎn)物多糖主要分布在下相，蛋白質(zhì)主要富集在中間相形成固體，上相主要含有非極性物質(zhì)，可有效改善多糖純度，因此，三相萃取作為一種有效的萃取分離方法，具有同時分離和富集目標(biāo)產(chǎn)物的作用。

2.3 螺旋藻多糖理化性質(zhì)

2.3.1 多糖紫外掃描圖譜

由圖2可知，在190～400 nm，260和280 nm處無吸收峰，表明該多糖溶液中不含核酸和蛋白質(zhì)。

圖2 螺旋藻多糖紫外可見波長掃描Fig.2 UV-vis wavelength scanning of the purified PSP

2.3.2 紅外光譜分析

由圖3可知，在4 000～500 cm-1，在3 384.81 cm-1和2 928.81 cm-1處具有O—H和C—H伸縮振動峰。

圖3 純化后螺旋藻多糖紅外光譜Fig.3 The FT-infrared spectra of the purified PSP

1 652.76 cm-1和1 373.74 cm-1處具有酯化羰基和羧基的伸縮振動峰。1 080.67 cm-1和1 035.14 cm-1處有吸收峰，說明螺旋藻多糖為吡喃糖。931.66 cm-1和762.03 cm-1有吸收峰，說明吡喃環(huán)有2種差向異構(gòu)體。

2.3.3 螺旋藻多糖的單糖組成

在相同處理條件下，保留時間是樣品單糖組成定性分析依據(jù)之一，采用GC對6種單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，由圖4-A可知，相應(yīng)色譜峰保留時間分別為：1. 鼠李糖(保留時間tR=12.95 min)； 2. 來蘇糖(tR=13.57 min)； 3.木 糖(tR=14.06 min); 4. 甘露糖(tR=19.65 min); 5.葡萄糖(tR=20.20 min); 6. 半乳糖(tR=21.20 min)；對螺旋藻多糖水解單糖組成和標(biāo)準(zhǔn)單糖對比，由圖4-B可知，螺旋藻多糖主要由鼠李糖、甘露糖和葡萄糖組成，其單糖組成物質(zhì)的量比值為5.14∶5.78∶81.37。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖(A)和螺旋藻多糖(B)的GC圖Fig.4 GC spectrum of monosaccharide references (A) and PSP (B)

2.3.4 螺旋藻多糖分子質(zhì)量測定

由圖5可知，螺旋藻多糖重均分子質(zhì)量Mw為3.597×104， 數(shù)均分子質(zhì)量為Mn=2.189×104，Mw/Mn=1.643，表明分子質(zhì)量分布具有均勻性。

圖5 螺旋藻多糖SEC-LLS結(jié)果Fig.5 SEC-LLS of PSP

2.3.5 螺旋藻多糖掃描電鏡形態(tài)觀察

圖6為不同放大倍數(shù)下三相萃取后螺旋藻多糖掃描電鏡圖，在5 000×放大倍數(shù)下觀察，螺旋藻多糖表現(xiàn)為具有致密結(jié)構(gòu)的球狀；10 000×放大倍數(shù)下，其呈現(xiàn)均一緊密球狀結(jié)構(gòu)；由于掃描電鏡技術(shù)用來觀察物質(zhì)表面狀態(tài),其結(jié)果可能與樣品干燥方法、外力作用等因素有關(guān)；有關(guān)其多糖內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其連接方式，有待進(jìn)一步分析。

A-10 000×；B-5 000×圖6 螺旋藻多糖掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope(SEM) photographs of the PSP

3 結(jié)論

本試驗采用三相萃取技術(shù)對螺旋藻多糖的分離和富集進(jìn)行了初步研究，并對制備的多糖結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了分析，為深入研究多糖結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

在三相萃取過程中，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、叔丁醇加入量、體系pH、萃取溫度和時間均對多糖得率產(chǎn)生一定的影響；通過紫外光譜、紅外光譜、掃描電鏡、凝膠滲透色譜、單糖組成檢測對三相萃取制備的螺旋藻多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，叔丁醇加入量為15 mL，體系pH為7.0，在35 ℃條件下，萃取30 min后，螺旋藻多糖得率為(9.25±0.42)%， 含量為(86.17±0.10)%。分子質(zhì)量測定表明其重均分子質(zhì)量為3.597×104；螺旋藻多糖主要由3種單糖組成，其摩爾比為:n(鼠李糖)∶n(甘露糖)：n(葡萄糖)=5.14∶5.78∶81.37；掃描電鏡結(jié)果顯示其為結(jié)構(gòu)緊密的球狀，在一定程度上反應(yīng)其與樣品處理方式有關(guān)。

與傳統(tǒng)的多糖提取方法相比，三相萃取屬于一種綠色、具有廣闊前途的萃取技術(shù)，具有同時分離目標(biāo)產(chǎn)物和除去其他雜質(zhì)的特性，可為其他天然產(chǎn)物中活性成分的有效分離提供技術(shù)支撐。