石榴酒發酵過程中香氣動態變化規律

唐柯，王茜，周霞，金杰，徐巖*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(安徽乳泉酒業有限公司，安徽 懷遠，233400)

石榴(PunicagranatumL.)系石榴科石榴屬，落葉灌木或小喬木，果實富含糖類、氨基酸、維生素和礦物質等營養物質，有溫補、軟化血管、降低血糖、血脂以及延緩衰老之功效[1]。石榴在我國已有兩千多年的栽培歷史，安徽是我國石榴五大主要產區之一，猶以安徽懷遠的玉石籽、紅瑪瑙、大笨子、青皮糙等聞名[2]。石榴酒是以石榴為原料經破碎、榨汁、低溫發酵、陳釀老熟而成，果香濃郁、口味酸飴、酒體醇厚的低度果酒，備受人們青睞[3-4]。石榴果酒酒精度低，營養價值高，風味獨特，成為提高石榴附加值、石榴深加工的首選方向[5]，同時也積極響應國家釀酒行業提出的“高度酒向低度酒轉變”、“蒸餾酒向釀造酒轉變”、“糧食酒向果露酒轉變”的倡導。石榴酒不僅風格獨特，更具有豐富的營養價值，以及較高的保健作用，符合現代人們追求高質量生活的要求，市場潛力巨大。風味是決定酒類品質的核心因素[6-8]，因此對風味物質的剖析也是實現石榴酒風味調控、品質提高的基礎。

目前國內外對于石榴酒相關研究已逐漸展開，ANDREU-SEVILLA等對石榴汁和石榴酒中揮發性化合物進行測定分析，發現在石榴汁中，萜烯類的檸檬烯是最豐富的揮發性化合物，而葡萄酒的揮發性成分則大不相同，辛酸乙酯明顯占主導地位[9]。WASILA等研究了石榴皮對果汁及酒感官、多酚組成和抗氧化能力的影響，結果表明，帶皮榨汁使果汁變苦變澀，但對石榴酒的感官品質有較好的改善作用，此外果皮可以貢獻更多的總酚以及類黃酮[10]。而國內的研究大多側重于對石榴酒工藝、抗氧化及功能成分方面的研究，如張憲宇[11]對石榴酒發酵工藝進行初探，研究了酵母的選擇、加糖和果汁的澄清等，并且釀造出了石榴發酵酒；劉月永等[12]在對釀酒酵母的選擇、發酵溫度以及SO2的添加這類研究的基礎上，釀制出了體積分數12%的干型石榴酒；唐虎利等13]以石榴為原料，采用短時浸漬控溫發酵生產石榴發酵酒，再將其加工，得到了石榴干紅酒；杜琨等[14]采用石榴果全汁低溫發酵，并研究了其發酵溫度、時間等，釀造出了低度的石榴果酒；田曉菊等[15]研究了影響石榴酒在發酵過程中甲醇和雜醇油生成量的影響因素，發現在相同條件下，甜石榴汁不僅比酸石榴汁會發酵得徹底，而且其中甲醇、雜醇油的含量也比酸石榴汁高；甲醇和雜醇油的含量與發酵溫度呈現正相關性。而有關風味物質特別是石榴酒釀造過程中的香氣動態變化規律則鮮有人探究[16]。

因此，本課題以安徽懷遠紅瑪瑙石榴為試材，采用SPME結合GC-MS，對紅瑪瑙石榴酒發酵過程不同時期香氣成分進行測定分析，研究石榴果酒釀制過程中香氣物質組成的變化，以及香氣成分的動態變化規律，以期為石榴果酒釀造工藝的進一步改進以及發酵過程中的風味控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴樣品由安徽乳泉酒業有限公司提供，品種為紅瑪瑙石榴。石榴酒發酵期間樣品：從加入酵母起，每隔24 h取樣1次，直至發酵結束。

2-辛醇、甲醇、二氯甲烷(色譜純)，美國Sigma-Aldrich公司；無水NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、偏重硫酸鉀(分析純)，上海國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水系統，美國Millipore公司；固相萃取裝置，美國Supelco公司；GC 6890N-MSD 5975氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司；DB-FFAP毛細管柱，美國Agilent公司；DC-12型氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 石榴酒的釀制

工藝流程：

石榴→清洗去皮→壓榨取汁→澄清殺菌(偏重硫酸鉀，60 mg/L)→接種酵母(D254, LAFFORT)→控溫發酵(26～28 ℃)→過濾裝瓶→石榴酒

1.3.2 理化指標的測定

總糖、總酸、pH、酒精度的測定參照GB/T15038—2006進行[17]。

1.3.3 萃取方法及儀器條件

檢測方法在MA等[18]的方法上稍作變動。采用固相微萃取三相頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)來吸附香氣化合物。取8 mL石榴酒樣品置于20 mL頂空樣品瓶中，加入3 g NaCl。在50 ℃下預熱平衡5 min， 隨后打開電磁攪拌器，將轉速調至400 r/min，插入刻度調至2.0的萃取頭，攪拌萃取45 min。

GC運行條件：樣品經過DB-FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm I.D.，0.25 μm)分離；進樣口的溫度為250 ℃， 不分流；載氣為He，流速為2 mL/min；柱溫升溫程序：初始溫度為50 ℃，穩定2 min后，以6 ℃/min的速率升溫至 230 ℃，并保持15 min。分離后的樣品，經過MSD5975檢測。

MS運行條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度為 230 ℃，掃描范圍設定30.00～500.00 amu。每個樣品重復測定3次，取均值。

1.3.4 物質定性與相對定量

物質定性：香氣活性成分的定性，通過與NIST 05質譜庫(Agilent Technologies Inc.)中標準譜圖進行檢索比對，并根據改進的Kovats法計算得到各物質保留指數(RI)進行確認[19]。

組分峰面積的相對含量：在頂空瓶的待測樣品中加入內標(2-辛醇，100 mg/L)，進行GC-MS分離。計算如公式(1)。

(1)

式中：Xi-待測物質相對含量；Cs-內標物質濃度；Ai-待測物質峰面積；As-內標物質峰面積。

2 結果與討論

2.1 理化指標的測定

對發酵前后石榴汁及石榴酒理化指標進行測定分析，結果表明(表1)，發酵前石榴汁的總糖為(121.97±1.56)g/L，pH為4.21，總酸(以檸檬酸計)為(5.97±0.23) g/L；發酵結束后殘糖降為(2.05±0.17) g/L，從殘糖含量可以看出發酵順利，達到了干型石榴果酒的要求。酒精度為(6.60±0.32)%(體積分數)，總酸為(6.52±0.31) g/L，發酵過程中酸度略有增加，與前人的研究結果基本一致[20]。

表1 石榴(汁)酒理化指標分析Table 1 Analysis of physical and chemical indexes of pomegranate wine (juice)

2.2 石榴酒釀制過程中香氣動態變化規律分析

采用質譜譜庫、保留指數比對的方法，鑒定出石榴酒發酵過程中游離態揮發性化合物的情況，香氣化合物及其相對定量詳見表2。

在石榴酒發酵全過程中，共檢測出123種揮發性化合物。石榴酒發酵過程中，揮發性化合物各類型化合物的檢出數量見表3。其中，發酵初始(石榴汁)共檢出25種，而隨著發酵的進行檢出的揮發性化合物種類也隨之增加。發酵第1天共檢出29種，發酵第2天共檢出44種，發酵第3天共檢出55種，發酵第4天共檢出59種，發酵第5天共檢出64種，發酵第6天共檢出62種，發酵第7天共檢出67種，發酵第8天共檢出67種。即從發酵第1天開始，揮發性化合物種類不斷增加，在發酵第5天時，揮發性化合物種類可以檢測到64種，隨后基本趨于穩定一直到發酵結束。由表3可以看出，發酵結束時酯類物質的種類最多，為34種，占到了總檢出個數的53%，其次是醇類物質，共檢出14種。本研究的結果也與李美萍等的研究結果基本一致，李美萍等采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用法分析石榴酒中揮發性化合物，總共確定了67種揮發性化合物，其中酯類物質23種，醇類物質16種[21]。

表4是石榴酒發酵過程中各類型化合物相對定量，醇、酸、酯三大類物質基本都是隨著發酵的進行含量也隨之增加，特別是發酵第3天，酯類物質含量較之前顯著增加，最終從發酵初始的163.09 μg/L上升到發酵結束后的1 928.48 μg/L，相對含量增加了將近12倍。酯類物質中，乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯相對含量均有顯著增加。醇類、酸類物質的含量也線性上升，醇類物質總量從發酵初始的282.94 μg/L升至發酵第8天的1 540.29 μg/L。醛類、酮類、烷烴類等揮發性化合物在整個發酵過程中，相對含量顯著降低。LAN等對石榴酒發酵過程中風味及抗氧化活性變化進行研究，他們發現風味質量的主要變化發生在發酵初期，特別是發酵0～4 d，發酵顯著降低了醛、酮、雜環和芳香族化合物的相對含量，但促進了酯類和醇類的生成。本研究結果與之基本一致[22]。

此外，在石榴酒中還檢測到一類比較重要的香氣物質—萜烯類物質。萜烯類化合物通常含量不高但是閾值較低，對香氣的貢獻很大，代表著水果的品種香[23]。由表3、表4可以看出，萜烯類化合物雖然總量上較發酵初始相差不大，但是種類上明顯增加。石榴汁中只檢測到β-蒎烯1種萜烯，而發酵結束后檢測到了香茅醇、α-萜品醇、檸檬烯等6種萜烯類化合物。萜烯類化合物在水果中通常都是以糖苷結合態形式存在的[24]，在發酵過程中通過酶解或者酸解釋放成可以感知的游離態香氣物質[25]。

表2 石榴酒發酵過程中的揮發性香氣化合物及其相對定量 單位：μg/L

續表2

續表2

注：RI-計算出的保留指數；RIL-文獻中查閱出的保留指數；“-”，未檢測到。

表3 石榴酒發酵過程中各類型香氣化合物檢出數量Table 3 The quantity of different types of aroma compounds during pomegranate wine fermentation

表4 石榴酒發酵過程中各類型香氣化合物相對定量Table 4 The relative amount of different types of aroma compounds during pomegranate wine fermentation

3 結論

本課題采用SPME-GC-MS，對紅瑪瑙石榴發酵過程不同時期香氣成分進行測定分析，研究石榴果酒釀制過程中香氣物質組成的變化及動態變化規律。在石榴酒發酵過程中，很多來源于石榴汁中的香氣物質發生了遷移，隨著發酵的進行，石榴酒中揮發性風味化合物也愈發增加。在石榴酒發酵全過程中，共檢測出 123種揮發性風味化合物。發酵初始(石榴汁)共檢出 25種，發酵第1天到發酵結束時第8天分別檢出 29、44、55、59、64、63、67、67種。在這些揮發性風味化合物中，酯類物質含量不斷增加，其中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯相對含量均有顯著增加。醇類物質與酸類物質隨著發酵的進行，相對含量也快速增加；醛類、酮類、醚類、烷烴類等物質相對含量則持續下降。此外，萜烯類化合物雖然總量上較發酵初始相差不大，但是種類上明顯增加。