生產菌種及環境微生物與腐乳品質關系研究進展

萬紅芳，趙勇，王正全，汪立平*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(上海海洋大學，食品熱加工工程技術研究中心，上海，201306) 3(農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室，上海，201306)

腐乳(sufu)又稱乳腐、霉豆腐，是以大豆為主要原料，經過浸泡、磨漿、點漿、制坯、前期培菌、腌制、裝壇、后期發酵而成[1-3]。腐乳是我國獨創的大豆發酵食品，已有1 000多年的生產歷史，其滋味鮮美、風味獨特、營養豐富，具有濃郁的民族特色[4]。腐乳按照顏色可分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳、花色腐乳等，根據前期發酵菌種的不同，還可將腐乳大致分為毛霉型、根霉型、細菌型3種類型[3-4]。

腐乳的發酵由多種微生物和酶協同參與，是一個復雜的生物化學過程[3]。腐乳作為一種典型“生物活性”發酵食品，其中微生物的種類及數目對其風味品質起著決定性的作用[4-5]。傳統的腐乳為“作坊式”生產，屬于自然發酵，微生物組成十分復雜；近半個世紀以來，多數廠家已實現純種接種進行前期培菌，但腐乳是開放式生產，難以避免生產環境中其他微生物侵入，進而參與腐乳的后期發酵。

由于對腐乳中微生物了解不夠全面，腐乳含鹽量高、生產周期長、品質不穩定等問題[2]一直沒有得到有效的解決。因此，雖然腐乳營養豐富、味道鮮美，這一產業卻難以蓬勃發展，無法打開國際市場。本文全面系統地總結了腐乳生產過程中存在的各種微生物，包括腐乳生產菌種(人工接種微生物)和從環境中侵入的其他微生物(非人工接種微生物)，并重點闡述了非人工接種的霉菌、酵母、芽孢桿菌、乳酸菌等對腐乳品質的影響。以期腐乳生產能夠充分利用有益菌，嚴格把控雜菌及有害菌，從而提高腐乳品質及穩定性、縮短生產周期、降低鹽含量，同時也為后續腐乳混菌發酵、新產品開發奠定基礎。

1 腐乳生產菌種(人工接種)

20世紀90年代以后，我國腐乳生產已基本實現通過人工接種的方式進行前期培菌[6]。由于各地氣候、地理環境、飲食文化的不同，國內不同地區腐乳各具特色，其中主導發酵的菌種也存在較大的差異，表1歸納了我國各地腐乳生產常用接種微生物，主要為毛霉、根霉、細菌等。

表1 腐乳接種微生物及其產地[1-3]Table 1 The starters of sufu and their production regions

1.1 毛霉

毛霉是全國各地腐乳生產使用量最多的菌種，約占90% 以上[2-3]。早在1928年，魏巖壽先生首次從腐乳中分離得到1株毛霉，將其命名為腐乳毛霉(Mucorsufu)，證實了毛霉對腐乳發酵起著重要的作用；1942年，方心芳從四川五通橋地區生產的腐乳中分離得到一株毛霉，將其命名為五通橋毛霉(Mucorwutungkiao)；此后，研究者們又相繼從各地腐乳中分離得到雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)、總狀毛霉(Mucorracemosus)、高大毛霉(Mucorracemosus)、魯氏毛霉(Mucorrouxianus)等，并逐步實現了以純種接種的方式生產腐乳，如北京王致和腐乳(雅致放射毛霉)、四川橋牌腐乳(五通橋毛霉)、江蘇紹興腐(腐乳毛霉)、八公山腐乳(總狀毛霉)[1-3]，表2歸納了目前我國用于毛霉型腐乳生產的菌種及其主要生長特征。

1.2 根霉

根霉與毛霉形態相似，分泌的酶系也類似，但毛霉生長溫度較低(≤30 ℃)，毛霉型腐乳的生產嚴重地受到季節和溫度的限制；根霉在30～40 ℃能較好地生長繁殖，受溫度的影響較小，且分泌的淀粉酶、脂肪酶、糖化酶活力較強[7]，因此非常適用于夏季高溫時腐乳的生產。目前應用于腐乳生產的根霉主要有以下幾種：米根霉(Rhizopusoryzae)、華根霉(Rhizopuschinonsis)、少孢根霉(Rhizopusoigoaporus)。米根霉菌落疏松或黏稠，菌絲體呈白色，成熟后變為灰褐色，在37～40 ℃能生長；華根霉菌落疏松或稠密，菌絲體呈白色，成熟后變為黑褐色，在45 ℃下仍能生長；少孢根霉是從印尼丹貝中分離而得，其菌絲體為白色，成熟后為褐色，在35～40 ℃下生長良好[8]。

1.3 細菌

接種細菌進行前期培菌而制成的腐乳即稱作細菌型腐乳，目前僅有黑龍江和武漢的一些地區生產該類型的腐乳。黑龍江地區使用的細菌菌種主要為藤黃微球菌(Micrococcusluteus)，其菌落呈淺金黃色，適宜生長溫度為25～27 ℃，可在質量分數5% NaCl中生長[9-10]；武漢的一些廠家使用的是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其菌落呈污白色、粗糙，最適生長溫度為30 ℃，可在質量分數7% NaCl中生長[10]，如表2所示。

表2 毛霉型腐乳菌種及其主要特征Table 2 Thestarters and their main characteristics of mucor-type sufu

2 生產菌種與腐乳品質關系

2.1 毛霉

毛霉能夠形成潔白而細高的菌絲，覆蓋于腐乳坯表層，賦予腐乳獨特的質感并能保持其良好的外形；毛霉還能分泌高活力的蛋白酶，大豆蛋白在蛋白酶的作用下發生水解，凝膠體破斷，生成多肽、縮氨酸、游離氨基酸等，增強腐乳營養的同時并賦予其獨特的鮮味。LIU等[13]研究了雅致放射毛霉接種腐乳在發酵過程中蛋白酶及化學組分的變化，發現腐乳在發酵過程存在多種不同分子質量的蛋白酶(162.6、124.6、104.3、66.9、44.9 kDa)，其中以中性蛋白酶含量較高，蛋白酶活力及種類與腐乳品質具有顯著的相關性。此外，毛霉蛋白酶具有較強的肽酶活性，如羧肽酶，催化水解多肽鏈羧基末端氨基酸，苦味肽被水解成游離氨基酸，進而去除或降低苦味[14-15]。

2.2 根霉

根霉也屬于毛霉目，因此與毛霉具有相似的形態和生長特性。雖然根霉可在夏季較高溫度下正常生長，不過與毛霉相比，根霉菌絲較為粗糙，蛋白酶活力也較低，所以根霉型腐乳成型不夠完整，其滋味也略遜色于毛霉型腐乳。李順等[7]對八公山腐乳總狀毛霉和米根霉的前期培菌進行比較，發現總狀毛霉發酵前期蛋白酶活力高于米根霉(42.79 μg/mL，33.51 μg/mL)，而淀粉酶、糖化酶、脂肪酶活力低于米根霉，但其中呈味氨基酸和疏水氨基酸差別不大，兩種菌發酵互有優勢。楊汶燕等[16]研究了3種不同發酵方式腐乳生化指標的動態變化，發現毛霉型腐乳氨基酸態氮、可溶性蛋白質相對較高，根霉型腐乳總酸、還原糖、總酯相對較高，而根霉和毛霉復合發酵腐乳可以同時使這些指標都保持在較高的水平。因此，利用根霉和毛霉混合接種腐乳進行前期培菌，不僅可減小溫度的影響，而且能解決成型不完整的問題，具有良好的應用前景。

2.3 細菌

相比于霉菌型腐乳，細菌型腐乳最大的特點是氨基酸含量非常高，因此滋味更加鮮美、質地柔軟而綿長。黑龍江克東腐乳作為一種細菌型腐乳，在國內眾多腐乳中獨樹一幟，具有明顯的地域特色。FENG等[9]對6種克東腐乳原生微球菌菌株進行發酵性能評估，結果表明，所選菌株既能避免高濃度生物胺的積累，又能保持典型的感官特性，同時又能保存傳統克東腐乳的風味質地。武漢地區芽孢桿菌腐乳生產相對較少[17]，主要是因為芽孢桿菌酶活力過高，容易導致蛋白質過度水解，難以保證腐乳良好的風味質地。此外，細菌型腐乳存在一個顯著的缺點，由于缺乏菌絲體的包裹，該類型腐乳難以保持完整美觀的外形，不適于長途運輸，因此往往只在當地銷售。

3 腐乳中混入的環境微生物(非人工接種)

雖然目前大部分腐乳的生產稱為“純種發酵”，但實際上，在腐乳制坯至裝壇的過程中，來自于原材料及環境中的各種微生物，已非常自然地侵入發酵菌種之中，并逐漸形成了穩定的微生物群落結構。研究者們利用傳統分離培養的方法，從腐乳中分離得到了多種非人工接種微生物，主要包括霉菌、酵母、芽孢桿菌、乳酸菌等[18-20]。

近些年來，隨著分子生物技術的發展，科研工作者們利用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)[20-21]、高通量測序(high-throughput sequencing，HTS)[22-23]等技術，不僅更加準確地鑒定了可培養微生物的具體類別，而且還發現了許多不可培養的微生物，這對全面了解腐乳中微生物群落結構，提高腐乳安全性具有重要意義。

3.1 霉菌和酵母

霉菌和酵母廣泛存在于自然環境中，腐乳在腌制至裝壇灌湯的過程中，極易遭受霉菌和酵母的侵染。從環境中混入腐乳的霉菌代表屬主要有曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、地霉屬(Geotricum)、鐮刀孢屬(Fusarlum)、毛孢子菌屬(Trichosporon)等，酵母代表屬主要有畢赤酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、酵母屬(Saccharomyces)、耶羅酵母屬(Yarrowia)等。

GU等[24]通過PDA培養基，從青腐乳(臭豆腐)中共分離獲得116株真菌，經過18S rDNA鑒定為26個種(表3)，結果表明，侵入腐乳中的霉菌和酵母種類繁多，且不同區域樣本中真菌種類的分布存在明顯的差異，這說明除生產用菌種外，腐乳中其他真菌組成也是具有地域性差異的。

表3 不同地區青腐乳中的真菌組成[24]Table 3 The composition of fungi of grey sufu in different regions

3.2 細菌

雖然添加大量食鹽在一定程度上抑制了雜菌的生長，但腐乳中細菌依然種類繁多，數目龐大，這主要是因為腐乳富含蛋白質、脂肪、碳水化合物、維生素等營養物質，為一些耐鹽和嗜鹽菌提供了較為適宜的生存環境。

HAN等[18]對3種不同類型(紅腐乳、白腐乳、青腐乳)的23個商品腐乳樣本中的微生物進行了調查，結果表明各種樣本中常溫需氧菌總數(total count of mesophilic aerobic bacteria，TMAB)都非常高(>105CFU/g)，而且85% TMAB為革蘭氏陽性菌，其中大部分為芽孢桿菌；此外，一些樣本中的乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)含量也相當大，數目可達106～107CFU/g，其中白腐乳中LAB數目要高于青腐乳，而紅腐乳中LAB數很少。

FENG等[20]研究了克東腐乳在發酵過程中細菌的群落結構，利用培養方法共分離鑒定了22種細菌(圖1)，發現腸球菌(Enterococcusdurans)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和變形桿菌(Proteusmirabilis)等為腐乳發酵過程中的優勢菌；通過PCR-DGGE方法共發現了27種細菌，其中優勢菌組成與培養方法結果一致，同時檢測到了多種培養方法未分離到的微生物，但是分離培養得到的幾株細菌并沒有在PCR-DGGE方法中檢測到，這說明2種方法都有一定局限性，結合使用多種檢測方法能夠更全面地了解微生物群落結構。

圖1 克東腐乳發酵過程中不同菌落形態特征[20]Fig.1 Morphology of different colonies of bacterial groups associated with Kedong sufu fermentation

劉亞棟[22]利用高通量測序的方法，對22份市售腐乳樣品中的細菌進行檢測，結果發現厚壁菌門(Firmicute)在腐乳細菌中占絕對優勢，該門下的優勢菌屬主要包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、梭菌屬(Clostridium)、腸球菌屬(Enterococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)等，通過聚類分析發現樣品間細菌群落組成和豐度差異較大。這進一步說明了腐乳中的微生物是具有地域環境差異，有必要對不同地區、不同類型腐乳中微生物動態變化進行深入研究。HTS作為近幾年新興發展的生物學技術，能1次對數百萬條DNA分子進行測序，可準確、快速地揭示樣本中的微生物多樣性及其群落組成，然而目前應用于腐乳的研究相對較少，利用傳統培養方法結合HTS技術來研究腐乳微生物的區系組成及動態變化將極具潛力。

4 混入腐乳的微生物與腐乳品質關系

侵入腐乳中的微生物種類繁多，結構復雜，既包括有利于發酵、促進風味形成的微生物，也存在一些導致腐敗變質甚至危害健康的雜菌及有害菌。因此了解這些微生物的類別及代謝對腐乳品質生產具有重要的意義。

4.1 霉菌

除菌種霉菌(毛霉和根霉)以外，環境中侵入多數霉菌并不有利于腐乳的發酵。人工接種菌種(毛霉和根霉)在數量上占優勢，可以競爭性抑制大部分環境霉菌侵入。不過在腐乳發酵的前一個月，曲霉菌屬、青霉菌屬、鐮刀菌屬微生物較為常見，這些屬下的多種霉菌已被證實可產生霉菌毒素，如黃曲霉素、橘霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等[25]，因此腐乳也極有可能受到霉菌毒素污染，這可能對人體健康安全具有潛在威脅。

HAN等[19]研究了不同含鹽量紅、白腐乳發酵過程中微生物的動態變化，發現所有腐乳樣品經后期發酵30d后，基本無真菌檢出(<101CFU/g)。這可能是因為在湯料中鹽和酒精的協同作用下，多數真菌特別是霉菌無法生長。不過即使霉菌基本上不會出現在腐乳發酵的最后階段，但其在發酵前期可能產生毒素，進而構成危害。

4.2 酵母

酵母常存在于各種發酵食品中，如豆醬[25]、香腸[26]、奶酪[27]、食醋[28]等，一般情況下不會引起腐敗變質，但其中一些類別過量生長，也有可能對腐乳外觀和風味造成不良影響，如膜醭畢赤酵母[29]。

此外，酵母細胞中酶含量豐富，能夠利用多種有機酸，可以將葡萄糖轉化為甘油、乙醇、異丁醇、異戊醇等物質，SONG等[30]對醬油發酵過程中酵母群落和揮發性風味變化進行監測，發現酵母種類與樣品風味密切相關，所以同為大豆發酵食品，酵母對腐乳的風味形成也應該具有一定的相關性。羅曉妙等[31]從自然發酵腐乳中分離得到酵母，并將其用于腐乳混菌發酵劑的研制，結果表明，添加體積分數10% 酵母菌液，可制得微生物活性良好的腐乳發酵劑。

4.3 芽孢桿菌

芽孢桿菌在自然界分布廣泛，而且芽孢具有很強抗逆性[32]，因此在各種類型、各種品牌腐乳中都能檢測到大量的芽孢桿菌(>105CFU/g)[18]。雖然武漢地區的一些廠家使用芽孢桿菌作為人工接種微生物，但絕大部分腐乳中的芽孢桿菌均是從環境中侵入的。腐乳中常見的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等[20,33]。

枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌可產生蛋白酶、α-淀粉酶、糖化酶等，是食品工業發酵的重要菌種[34]；此外，它們能夠分泌多種抗菌物質，可以抑制病原菌的生長甚至殺滅有害微生物，是目前使用較為廣泛的益生菌。GAO等[35]從腐乳中分離鑒定了一株枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCF-3)，結果表明CF-3具有良好的抗真菌穩定性，可用于水果病害防控。

然而，蠟樣芽胞桿菌是一種條件致病菌，可以產生腹瀉毒素和嘔吐毒素導致人類中毒[32]，張金蘭等[36]對來自市場的52個腐乳樣品進行了調查，發現不同腐乳中蠟樣芽孢桿菌的含量為10～105CFU/g；HAN等[18]在調查研究的23個腐乳樣本中，發現其中3個樣本蠟樣芽胞桿菌含量超過105CFU/g。ANDERSSON等[37]指出，當食品中蠟樣芽孢桿菌數高于103CFU/g時，對消費者將有潛在的危害，我國國家衛生計生委發布的《蠟樣芽胞桿菌食物診斷標準及處理原則》(W/S 82-1996)中規定蠟樣芽胞桿菌食物中毒判斷標準為105CFU/g。我國腐乳產業規模已經超過百億[38]，但其所面臨的質量安全問題卻非常嚴重，蠟樣芽胞桿菌的數量已經直接影響到了腐乳的出口。

4.4 乳酸菌

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)種類和數目在不同類型、不同含鹽量腐乳中具有很大差異(102～109CFU/g)。一般低鹽、白腐乳中LAB數目較高，而高鹽、紅腐乳中LAB數目很少[18-19,23]。這主要是因為高濃度的食鹽對LAB具有較強的抑制作用，紅腐乳中的紅曲霉也可以抑制LAB的生長[39]。

腐乳中常見的LAB主要為鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)等，它們在釀造食品中起著非常重要的作用[40]。LAB能產生多種抗菌物質及代謝產物，如細菌素、過氧化氫、雙乙酰等，不僅可以抑制產毒細菌，還有抗霉菌的特性[41]，腐乳中乳酸菌的存在往往有利于控制有害菌的生長，延長腐乳保質期。馬艷莉等[42]利用乳酸菌制作豆坯生產低鹽腐乳，并對其理化、微生物和感官指標進行研究，結果發現，乳酸菌低鹽腐乳中氨基態氮和水溶性蛋白含量顯著高于對照組，而細菌總數和芽孢桿菌數低于對照組，且感官評價總體接受較好。羅曉妙等[31]在多菌種腐乳發酵劑的研制中發現，LAB比例對腐乳發酵物形態影響較大，需添加體積分數10% 的LAB菌液，才可獲得良好生物活性的發酵劑。

不過多項研究表明腐乳中屎腸球菌(Enterococcusfaecium)含量往往較高[20-22]，這是具有一定爭議性的，因為屎腸球菌屬于腸道菌，腐乳中出現大量該菌，表明很可能直接或間接受到糞便污染。不過研究者們從各種奶酪中也常常會檢測到大量屎腸球菌的存在[27,43]，且沒有檢測到大腸菌群，這表明一些發酵食品中的屎腸球菌并不一定是糞便污染所致，而是其中微生物菌群正常組成部分。

5 結論

腐乳風味獨特、營養豐富，在世界發酵食品中獨樹一幟，在千年的歷史長河中，腐乳給廣大勞動人民增添了許多“美好的滋味”。隨著生活水平的提高，人們越來越渴望營養美味、健康安全的食品，然而，由于微生物研究不夠全面深入，腐乳中可能存在一些質量問題和安全隱患，有害霉菌、蠟樣芽胞桿菌菌群普遍存在于各地區、各類型腐乳中，這嚴重制約了腐乳行業的發展；不過腐乳中也存在許多具有多種酶系、抑制有害菌生長的有益微生物(如乳酸菌)，其對腐乳風味的形成、保質期的延長至關重要。因此，除了要選取優良菌種進行前期培菌，也要加強腐乳后期發酵過程中微生物的研究，通過傳統培養方法與PCR-DGGE、HTS等現代分子生學技術結合，全面了解不同腐乳中微生物組成及動態變化，深度挖掘微生物資源，在分離篩選功能菌的同時，嚴格把控雜菌和有害菌。為了全面提高腐乳質量，保證其安全性，多菌種混合發酵是今后腐乳研究和生產的必然之勢。