水綿發酵產乙醇工藝構建及條件優化

田育青，張 秀，朱 密，何軍良，周 旋

(1.武漢工程大學化學與環境工程學院，湖北 武漢 430205;2.華中科技大學環境科學與工程學院，湖北 武漢 430074)

《2018中國環境狀況公報》指出，我國地表水的主要污染指標為氨氮、總磷、揮發酚、有機物等，此類污染物質能刺激浮游藻類大量繁殖，使得水體呈現富營養化特征[1]。近年來，將藻類修復技術應用于處理污染水體得到了廣泛的關注[2],如張聰[3]將水綿用于去除城市污水處理廠二級處理出水中氮、磷、COD等污染物，使出水達到了一級A標準；雷國元[4]研究了水綿與團集剛毛藻去除氮、磷等污染物的效率，并探究了水綿抑制微型藻類生物生長的性能與機制，指出將大型絲狀綠藻用于處理富營養化的自然水體是可行的。大型絲狀綠藻的主要成分—碳水化合物最多可達藻干重的70%[5]，由于其生物量巨大以及富含碳水化合物，能夠產生的乙醇量是木材的4倍，干草的5倍[6]。蔣媛媛[7]采用銅藻發酵產乙醇，以原料計算乙醇的得率可達到11%；劉茂玲[8]分別用螺旋藻、藍藻以及水葫蘆發酵產乙醇，乙醇的得率可分別到達7.6%、35.1%、5.1%。乙醇具有清潔無污染、燃燒值高、可再生等優點，被公認為是常規化石燃料的理想替代品[9]。目前，國內外對藻類產乙醇的研究較多，但是與水綿的相關研究較少[10]。因此，構建水綿發酵產乙醇的工藝并對工藝參數進行優化，打通水綿治理污染水體的“最后一公里”，拓寬生物乙醇的原料來源，可為我國藻類制備乙醇提供新思路與技術基礎，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 水綿干燥樣

武漢東湖湖泊水環境質量為Ⅳ類，輕度富營養化，主要超標項目為總磷和化學需氧量[11]。試驗所用水綿取自武漢東湖(2018年2～3月份)，將其沖洗后曬干，粉碎過篩并保存。

1.1.2 主要試劑

主要試劑有：濃硫酸(98%，分析純,武漢志遠天合化工有限公司)；纖維素酶(活度為10萬u/g，和氏璧生物科技有限公司)；釀酒酵母菌(南寧廣龍工貿有限責任公司)。

1.1.3 主要溶液

(1) 水綿稀酸預處理混合物：配制總體積為600 mL，量取18 mL的98%濃硫酸稀釋后，向錐形瓶中加入20 g的水綿干燥樣，在100℃的條件下，攪拌2 h。

(2) 酵母活化液：稱量10 g淀粉與蒸餾水混合，微沸10 min，待冷卻后與5 g酵母粉充分混合，使用1 L容量瓶定容，于30℃封閉遮光48 h后，用于試驗。

(3) 發酵輔助營養液：3 g/L蛋白胨，0.25 g/LCaCl2，0.25 g/L MgSO4，2.5 g/L KH2PO4。

1.2 試驗裝置

為了使水綿中纖維素、淀粉等可發酵的碳水化合物充分參與發酵反應，設計了水綿發酵產乙醇試驗裝置，詳見圖1。

試驗過程為：首先將經粉碎過篩處理后的水綿干燥樣置于預處理罐中，使用稀硫酸處理一段時間；然后將其在預水解罐中使用纖維素酶進行進一步處理，再將預水解后的水綿放置發酵罐中，加入一定量的發酵輔助液與酵母活化液，發酵一段時間后進行固液分離；最后將分離后的固態物質與液體密封保存，產物乙醇主要存在于液體之中。

該試驗裝置所具備的特點是：稀硫酸在破壞木質纖維結構的同時，可以使小部分的纖維素以及大部分的半纖維素水解成葡萄糖、木糖等可溶性單糖[12-13]，并釋放熱量，這不僅縮短了酶水解的時間，為水解提供了適宜的酸性環境，也降低了酶水解溫度控制的能耗；酶水解與發酵過程在分散并行系統中進行，在解決酶解產物(纖維二糖、葡萄糖等)對酶催化產生的抑制作用[14]、水解與發酵過程溫度不一致問題的同時[15]，有效地降低了發酵過程中溫度控制的能耗；除此之外，發酵輔助液體與酵母活化液混合制備，是縮短產乙醇周期的關鍵技術。

1.3 試驗方法

1.3.1 水綿干燥樣成分的測定

水綿干燥樣的水分按照《食品安全國家標準——食品中水分的測定》(GB 5009.3—2016)中的方法測定；灰分按照《飼料中粗灰分的測定》(GB/T 6438—2007)中的方法測定；粗纖維按照《植物類食品中粗纖維的測定》(GB/T 5009-10—2003)中的方法測定；纖維素和半纖維素按照參考文獻[16]中的方法測定；淀粉按照《食品安全國家標準——食品中淀粉的測定》(GB 5009-5—2016)中的方法測定。

圖1 水棉發酵產乙醇試驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of ethanol production by Spirogyra fermentation

1.3.2 乙醇濃度的測定

產物乙醇濃度按照參考文獻[17]中的方法測定。

1.3.3 單因素試驗

選取預處理混合物中稀硫酸用量、纖維素酶用量、預水解時間、預水解溫度、發酵時間和發酵溫度共6個單因素，利用圖1裝置進行單因素試驗。

試驗分組設計如下：試驗組①預處理混合物(制備見第1.1.3節)的初始pH值分別為3、4、5、6、6.5，纖維素酶用量為2.000 g，預水解時間為50 min，預水解溫度為50℃，發酵溫度為30℃，發酵時間為12 h；試驗組②纖維素酶用量分別為0.250 g、0.500 g、0.750 g、1.000 g、1.500 g、2.000 g，預處理混合物的初始pH值為5左右，其余條件同實驗組①；試驗組③預水解時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min，其余條件同上；試驗組④預水解溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，其余條件同上；試驗組⑤發酵溫度分別為20℃、30℃、40℃、45℃、50℃，其余條件同上；試驗組⑥發酵時間分別為5 h、10 h、15 h、20 h、25 h，其余條件同上。

1.3.4 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，設預水解時間、發酵時間、發酵溫度為自變量(原因詳見2.2)，產物乙醇的濃度為響應值，基于Design-Expert軟件，利用響應面中心組合設計法得到各因素水平值(見表1)，并采用響應面分析法，得到水綿發酵產乙醇工藝參數的回歸模型。

表1 響應面法的各因素水平

1.3.5 水綿發酵產乙醇工藝全過程的優化

在回歸模型預測出的最佳試驗條件下，進行了放大10倍的產乙醇試驗。在發酵過程中，每隔2 h進行一次乙醇濃度的測定，并采用Logistic模型[18][模型數學表達式見式(1)]，基于1st Opt軟件，對產物乙醇濃度的變化情況進行非線性擬合與優化，以得到能較好地描述水綿發酵產乙醇全過程的分段優化模型。

(1)

式中：p為t時刻乙醇濃度(g/L)；p0為t0時刻對應的初始乙醇濃度(g/L)；pmax為理論最大產乙醇濃度(g/L)；vmax為理論最大乙醇產生速率[g·(L·h)-1]；t為發酵時間(h)。

2 結果與分析

2.1 水綿干燥樣的成分

水綿干燥樣主要成分及其含量的測定結果，見表2。

表2 水綿干燥樣主要成分及其含量(%)

注：含量取平均值，測定誤差在5%以內。

由表2可知，水綿干燥樣中含有67.53%的淀粉、纖維素、半纖維素等碳水化合物,由此可見采用水綿發酵產乙醇具有巨大的潛力。

2.2 單因素試驗結果與分析

不同因素對產物乙酵濃度的影響，見圖2。

由圖2(a)可知，pH值從3.0變化至5.0再至6.5的范圍內，產物乙醇濃度(平均值表示，下同)先上升隨后下降，這可能是稀硫酸處理水綿干燥樣存在著最佳用量。有研究表明，稀硫酸用量低(pH值較高)時，不能有效地處理干燥樣，而用量過高(pH較低)時，導致干燥樣中有機物質炭化[19]。因此，在后續的響應面試驗中，將初始pH值控制在5.0左右，即選定預處理固液混合物中硫酸的含量為3%。

圖2 水棉發酵產乙醇工藝中不同因素對產物乙醇濃度的影響Fig.2 Influence of related factors on ethanol concentration

由于纖維素酶成本高阻礙了纖維發酵產乙醇的工業化[20]，除了開發廉價且高效的纖維素酶外，根據具體的反應研究纖維素酶的最佳用量也是降低成本的一種重要途徑。由圖2(b)可見，當纖維素酶用量低于1 g酶/g干燥樣時，產物乙醇的濃度隨纖維素酶用量的增加幾乎呈線性增加；但當纖維素酶用量超過1時，產物乙醇的濃度變化趨于穩定。因此，在后續的響應面試驗中將纖維素酶的用量選定為1 g酶/g干燥樣。

預水解時間的長短，將會影響纖維素酶的作用效果。由圖2(c)可見，預水解時間在0～50 min范圍內時，產物乙醇的濃度隨預水解時間的增加而增加，當預水解時間超過50 min時，產物乙醇的濃度基本趨于穩定。因此，在后續的響應面試驗中將預水解時間的區間設定為40～60 min。

預水解溫度能直接影響纖維素酶的活性，從而影響產物乙醇的濃度。但纖維素酶是起協同作用的多組分酶系，所以溫度在適當范圍變化對多組分酶系的影響較小，可能會使得乙醇產量的變化不顯著。由圖2(d)可見，在試驗溫度范圍內，產物乙醇的濃度總體變化趨勢較為平緩，最佳預水解溫度在50℃～55℃范圍內。因此，結合考慮預水解的能耗，在后續的響應面試驗中將預水解溫度選定為50℃左右。

發酵溫度能直接影響酵母活性，從而對產物乙醇的濃度產生影響。由圖2(e)可見，產物乙醇的濃度隨發酵溫度的變化較為顯著，當發酵溫度在40℃左右時，產物乙醇的濃度達到了最高值。因此，在后續的響應面試驗中將發酵溫度選定為40℃左右。

發酵時間短，會導致發酵不完全，但發酵時間過長，則會增加生產成本。由圖2(f)可見，發酵時間少于15 h時，產物乙醇的濃度隨發酵時間的增加不斷增高，但繼續延長發酵時間后，產物乙醇的濃度變化趨于平緩。因此，在后續的響應面試驗中選擇發酵時間為10～20 h。

2.3 響應面試驗結果與分析

按照前述響應面設計方案進行試驗，并對試驗結果進行多元回歸擬合，得到水綿制備乙醇的初步回歸擬合模型如下：

Y=-9.37+0.29A+0.29B+0.14C+2.8×10-3AB+3.5×10-4AC+1.95×10-3BC-3.212×10-3A2-0.014B2-1.487×10-3C2

(2)

式中：Y為乙醇濃度(g/L)；A為預水解時間(min)；B為發酵時間(h)；C為發酵溫度(℃)。

上述回歸擬合模型的決定系數見表3，該回歸擬合模型的方差分析結果見表4。

表3 回歸擬合模型的決定系數

表4 響應面二次式模型的方差分析結果

由表3和表4可知，初步回歸模型的F值為152.12，p值<0.000 1(<0.050 0)，“Pred R-Squared”為0.918 6，“Adj R-Squared”為0.988 4，反映信噪比的“Adeq Precision”為38.714(>4)。由此可見，該模型在所選擇的因素水平范圍內，可較為準確地預測A、B、C三因素交互作用下的產乙醇濃度，且此模型只有0.01%的概率發生幅度改變，即模型是合理的。

2.4 最佳產乙醇條件及其產量分析

根據上述所得到的初步回歸模型[(式(2)]，基于BBD模塊，構建了不同因素與產物乙醇濃度關系的三維響應曲面以及相應的等高線，見圖3。

由圖3(a)可見，預水解時間與發酵時間對乙醇濃度的影響較為明顯，其中在選取的條件范圍內，預水解時間的變化對乙醇濃度的影響更大；由圖3(b)可見，發酵溫度與預水解時間對乙醇濃度的影響較為明顯，其中發酵溫度對乙醇濃度的影響更大；由圖3(c)可見，發酵時間與發酵溫度對乙醇濃度的影響較為明顯，其中發酵溫度對乙醇濃度的影響更大。因此，在研究范圍內可以得出：預水解時間、發酵時間和發酵溫度三參數之間的交互作用對乙醇濃度的影響較為明顯；對乙醇濃度的影響作用按照從大到小的順序排序為：發酵溫度>預水解時間>發酵時間。其中，通過模型預測出的最高產乙醇濃度為5.71 g/L，其條件為預水解時間56 min左右、發酵時間為19 h左右、發酵溫度40℃左右。然而在實際情況下，往往將最高乙醇產量與實際生產結合考慮，即可得到“最佳產乙醇條件”概念。通過此模型，得到了最佳產乙醇濃度為5.46 g/L，其條件為預水解時間52 min左右、發酵時間14 h左右、發酵溫度40℃左右。“最佳產乙醇濃度”較“最高產乙醇濃度”相差約0.25 g/L(僅占最高產乙醇濃度的4.5%)，但可節省大約5 h左右的產乙醇時間，能顯著地縮短產乙醇周期。在最佳產乙醇條件下，進行重復試驗得到實際產乙醇濃度平均值為5.61 g/L，與模型預測值5.46 g/L相差2.7%(<5%)。因此，該模型預測出的最佳產乙醇條件及其產量是可靠的。

2.5 水綿發酵產乙醇全過程預測

2.5.1 產乙醇全過程的非線性擬合

本文采用Logistic模型對水綿發酵產乙醇全過程進行非線性擬合，模型預測得到的乙醇濃度平均值與乙醇實際濃度平均值及其兩者比較的相對誤差，見表5。

表5 乙醇預測濃度與實際濃度平均值的比較及其相對誤差

經計算可知，模型擬合的決定系數R2為0.998 9，表明Logistic模型整體表現出較好的擬合效果。

由表5可知，發酵時間從8 h到18 h，模型的預測濃度與實際濃度的相對誤差均小于5%，符合擬合標準，但發酵時間從0 h到8 h，模型的預測濃度與實際濃度的相對誤差均大于5%，達不到擬合的標準。因此，須對發酵時間為0 h至8 h的時間段的模型進行進一步優化。

圖3 不同因素與產物乙醇濃度關系的三維響應曲面以及相應的等高線Fig.3 Three-dimensional response surface of related factors and product ethanol concentration and the corresponding contour

2.5.2 產乙醇全過程數學模型優化

通過對發酵時間為0 h至8 h時間段的模型進行進一步優化，得到其數學表達式如下：

(3)

式中：p為乙醇濃度(g/L)；t為發酵時間(h)。

產乙醇全過程分段模型的擬合效果見圖4。

圖4 產乙醇全過程分段模型方程的擬合效果Fig.4 Fitting degree of segmented model equation for the whole process of ethanol production

由圖4可見，分段擬合后，乙醇濃度預測值與試驗實測值的相對誤差均小于5%，其中決定系數R2在0 h至8 h、8 h至18 h兩個時間段分別為1和0.998 9。因此，使用此分段模型方程對產乙醇的整個周期進行擬合與預測，具有較強的可靠性。通過對式(3)進行分析，可得到最大乙醇濃度為5.715 8 g/L(實際最佳產乙醇濃度為5.61 g/L，兩者誤差小于5%)，最大乙醇產生速率為0.691 9 g/[g/(L·h)]。

3 結論與展望

通過對水綿干燥樣成分的測定以及水綿發酵產乙醇工藝的優化，得到以下結論：

(1) 水綿干燥樣中約含有67.53%的淀粉、纖維素等可發酵產乙醇的碳水化合物，因此水綿發酵產乙醇具有較大的潛力。

(2) 在所選研究因素的范圍內，預水解時間、發酵時間與發酵溫度對最終的乙醇得率有顯著的影響，這些影響因素之間具有交互關系，并非獨自作用。在600 mL的預處理料液混合物(含20 g水綿干燥樣、18 mL的98%濃硫酸)、150 mL的酵母活化液與200 mL的發酵輔助營養液組成的1 L發酵體系中，最佳產乙醇條件為:纖維素酶(10萬u/g)與水綿干燥樣的投加質量比為1∶1、預水解溫度50℃、預水解時間50 min、發酵溫度40℃、發酵時間14 h。其對實際乙醇生產中，最優工藝參數的選擇具有指導意義。

(3) 在優化后的工藝條件下，得出了最大乙醇濃度為5.715 8 g/L，最大乙醇產生速率為0.691 9 g/[g/(L·h)]等重要發酵參數，這些參數對產乙醇全過程的調控具有指導意義。

生物乙醇是當今發展迅速的液體生物質能[21]，因其具有清潔無污染、燃燒值高、可再生等優點[22]已被公認為是常規化石燃料的理想替代品[6]。藻類已被列入第三代生物能源，并已被研究者們成功應用于制備生物乙醇等領域，是能源制備領域最有前景的候選原料之一[23]。水綿作為具備發酵產乙醇潛力的藻類之一，具有生長周期短、適應性強、打撈成本低等特點，若能將水綿規模化人工養殖與治理污水同步、水綿產乙醇應用與能源政策相對接，這將在產生巨大環境效益的同時，帶來可觀的經濟效益。