保加利亞乳桿菌的發酵培養基優化

楊陽 楊波

摘 要：采用響應面法對保加利亞乳桿菌的培養基進行優化，Plackett-Burman （PB）設計對培養基中各因素影響的效應進行評價，結果表明：糖蜜、工業蛋白胨和CaCO3對生物量影響顯著。

關鍵詞：保加利亞乳桿菌;培養基優化;響應面

乳酸菌主要存在于畜、禽腸道以及奶制品、酒曲等食品中，其作為微生態制劑還廣泛地應用于食品[1]、保健[2，3]和動物飼料等領域;乳酸菌具有抗菌、維持微生態平衡[4]、抑癌和增強免疫力[5]等重要功能，且能賦予食品特殊的風味，是極有價值和開發前景的菌種。因而，研制經濟實惠、易收獲菌體且活菌數高的增殖培養基是大多研究者共同關心的問題。

在乳酸菌優化培養基研究方面，劉云鶴等[6]通過正交及混料回歸試驗確定了高效經濟的乳酸菌增殖培養基配方，可使發酵液中的乳桿菌和植物乳桿菌的活菌數分別達到 6.02×109 cfu/mL、5.88×109 cfu/mL。付榮霞等[7]通過正交實驗研究了幾種果蔬汁的添加量、培養時間、黃豆發芽時間對乳酸菌生長的影響，確定了最優的發酵工藝，在此條件下，乳酸菌的菌數為13.8×107 cfu/mL，pH為3.97。本研究在MRS的基礎上，對其培養基配方進行了優化，選出了對保加利亞乳桿菌適合規模化生產的發酵培養基，對后期高密度發酵及活性乳酸菌的制備有指導意義。

1? 材料與方法

1.1? 材料與儀器

1.1.1? 材料

保加利亞乳桿菌：購于中國工業微生物菌種保藏中心（CICC 23764）。

1.1.2? 培養基

菌種斜面培養基（MRS培養基）：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、磷酸氫二銨2.0 g、吐溫80 1.0 mL、乙酸鈉5.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、七水硫酸鎂0.58 g、一水硫酸錳0.25 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，固體培養基中加入2%的瓊脂，pH 6.4。

種子培養基、優化前的基礎培養基：MRS培養基，250 mL 三角瓶，裝量50 mL。

1.2? 方法

1.2.1? 生物量的測定

細胞OD值的測定：取菌體發酵液5 mL加入10 mL的離心管中，5000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀（菌體），再加入5 mL的蒸餾水反復搖勻洗滌，離心棄上清，重復洗滌至無色。稀釋后的菌體在600 nm 波長處，用蒸餾水作空白進行測定，OD600nm=OD讀數×稀釋倍數[8]。

1.2.2? 培養基優化

通過單因子試驗確定保加利亞乳桿菌培養基的最適碳、氮源，用Design Expert 8.0軟件中2水平篩選出影響保加利亞乳桿菌生物量的顯著因子，再通過爬坡試驗和響應面分析對顯著因子的水平進行優化[9]。

2 結果與分析

2.1? Plackett-Burman試驗設計與分析

考慮到實際生產中的原料成本及來源，選定糖蜜、工業蛋白胨進行單因素優化預試驗，確定其最佳濃度分別為150 mL/L和3%（資料未顯示）。

用Design Expert按Plackett-Burman實驗設計進行實驗，將各個因素設計成高 （+1） 和低 （-1） 2個水平，高水平是低水平的1.25倍。

Plackett-Burman實驗設計每組的實驗結果，根據此結果進行顯著性分析，糖蜜、酵母粉、工業蛋白胨、磷酸氫二鉀、一水硫酸錳和磷酸氫氨表現為正效應，七水硫酸鎂和碳酸鈣表現為負效應。糖蜜、工業蛋白胨、酵母粉、碳酸鈣的P值分別為0.0248、0.0160、0.0277、0.0261，可信度均大于95%，表現為顯著。工業蛋白胨的濃度對乳酸菌生物量影響最大，其次是糖蜜和碳酸鈣。因此確定工業蛋白胨、糖蜜、碳酸鈣為主要影響因素，進行下一步實驗。

2.2? 響應面分析的試驗設計及結果

根據最陡爬坡實驗確定了顯著因素濃度的取值區間。利用Design Expert進行中心組合的實驗設計，將最陡爬坡試驗的3 個因素糖蜜、工業蛋白胨和碳酸鈣分別標記為X1、X2、X3，以發酵10 h后的OD值作為響應值，記為Y，各變量水平見表4，實驗結果見表5。根據表5的實驗結果通過Design Expert進行顯著性分析，建立多元二次回歸方程：

Y=6.53+0.033X1+0.12X2-0.034X3+0.016X1X2-0.16X1X3-0.034X2X3-0.11X12-0.12X22-0.14X32

方程的方差分析結果，模型大于F值的概率P<0.01，表明模型非常顯著，對響應值Y的影響非常顯著，可信度較高;模型失擬項的P值為0.1251，不顯著，決定系數R2=0.9162，說明因變量與考察的自變量之間的線性關系顯著;綜上所述，使用該模型可以較好的對響應值進行分析和預測。

2.4? 最佳濃度的確定及驗證試驗

根據上述回歸方程，以確認糖蜜、工業蛋白胨、碳酸鈣3個因素對乳酸菌生物量的影響，3個因素兩兩相互作用的圖像開口均是向下的，說明可以由擬合方程求出預測的生物量的最大值。由Design Expert軟件分析得到最適培養基組成為糖蜜180 mL/L，工業蛋白胨3.52%，碳酸鈣0.15%，酵母浸粉3%、磷酸氫二鉀0.2%、七水硫酸鎂0.15%、輕質碳酸鈣0.1%、一水硫酸錳0.002%、磷酸氫氨0.15%。預測在此組成條件下，乳酸菌生物量最大，OD600nm值為6.50。

參考文獻：

[1] 楊潔彬. 乳酸菌[M]. 輕工業出版社， 1996.

[2] 陳杰， 徐沖， 孫翠煥，等. 乳酸菌在食品工業中的應用現狀及發展前景[J]. 微生物學雜志， 2012， 32（3）：91-94.

[3] 田永峰， 吳天祥， 胡曉瑜，等. 乳酸菌在釀造和食品工業上的應用[J]. 釀酒科技， 2007（4）：90-93.

[4] 趙龍飛. 乳酸菌的保健功能及其在食品中的應用研究[J]. 中國調味品， 2009， 34（6）：30-33.

[5] 張金桃， 周傳云， 侯愛香. 乳酸菌的保健功能及其保健機理的研究[C]// 益生元國際論壇. 2007.

[6] 劉云鶴. 高效乳酸菌增殖培養基的篩選[J]. 淮海工學院學報.自然科學版， 2003， 12（4）：59-62.

[7] 付榮霞， 鮑雅楠， 崔艷，等. 幾種果蔬汁對乳酸菌增殖的影響[J]. 貴州農業科學， 2012， 40（6）：187-189.

[8] Romanos M A， Scorer C A， Clare J J. Foreign gene expression in yeast： a review[J]. Yeast， 1992， 8（6）： 423-488.

[9] Velly H， Fonseca F， Passot S， et al. Cell growth and resistance of Lactococcus lactis subsp. lactis TOMSC161 following freezing， drying and freeze-dried storage are differentially affected by fermentation conditions[J]. Journal of Applied Microbiology， 2014， 117（3）： 729-740.