江華苦茶的親緣關系與遺傳多樣性研究

成 楊，劉 振，趙 洋，楊培迪，羅軍武，楊 陽*

（1.湖南省農業科學院 茶葉研究所，國家茶樹改良中心 湖南分中心，湖南 長沙 410125；2. 湖南農業大學 園藝園林學院 茶學系，湖南 長沙 410125）

江華苦茶是1987年湖南省認定的優良地方群體品種，主要分布在湖南省南嶺山脈江華瑤族自治縣，是寶貴的茶樹資源[1]。DNA序列分析是區分個體間遺傳差異最直接的方法，可提供基因組特異區的完全遺傳信息，在植物的物種系統進化、分類和鑒定等方面起到了非常重要的作用[2-3]。作為DNA序列分析的一個部分，cpDNA序列有著相對保守、基因組較小、多拷貝、母系遺傳的特點，被運用于各種層次的系統學研究[4-5]，如被子植物基部類群[6]與物種系統進化研究[7]等，也有利用cpDNA進行山茶屬植物的親緣關系研究[8]。SSR分子標記具有通用性高、共顯性遺傳和多態性好等特點，是構建分子遺傳連鎖圖譜、圖位克隆、品種鑒定與指紋圖譜、親緣關系和遺傳多樣性研究以及輔助選擇育種的有用工具，被廣泛應用于茶樹遺傳多樣性和群體遺傳結構等研究[9-14]，但是傳統的SSR分子標記方法存在操作復雜、耗時耗力、不同批次數據整合困難、實驗安全風險大等不足，給SSR標記在茶樹中的應用帶來一定困難[15-16]。

本研究在對江華苦茶進行調查的基礎上，采用熒光SSR分子標記與cpDNA序列分析技術相結合的方法，對4個江華苦茶自然居群的32份資源進行了群體遺傳多樣性、遺傳結構和遺傳分化研究，探討江華苦茶的親緣關系、遺傳多樣性水平及群體遺傳結構，為江華苦茶資源的收集、保護和研究提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

參試的32份茶樹種質資源：江華瑤族自治縣27份，其中碼市鎮龍灣村9份（MS）、蔚竹口鄉12份（WZK）和大錫鄉6份（DX），均為樹齡較大、小喬木型的典型古茶樹資源；湖南省茶葉研究所茶樹種質資源圃苦茶資源5份（CYS）。實驗材料均取一芽二葉新梢，液氮迅速冷凍處理，將其保存在-40℃冰箱中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物合成

本研究采用3對cpDNA引物（表1），cpDNA序列為團隊前期篩選的結果，由天根生化科技有限公司進行引物合成。15對SSR引物為團隊已有的篩選結果，由上海生工公司合成，為了便于基因分型，在引物的5'端增加了一段序列（5'-CGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'），反應體系中增加了一個熒光標記引物（5'-FAMCGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'）。

表1 cpDNA引物序列Table 1 cpDNA primer sequence

1.2.2 PCR擴增

cpDNA測序的擴增體系見表2、PCR反應程序見表3，擴增完成后，隨機抽取擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物送上海生工生物技術有限公司進行測序。SSR擴增體系見表4，采用降落式PCR，包括3個touchdown循環和后續的35個標準循環。起始變性溫度為 94℃ 3 min，3個 touchdown循環為 94℃變性 30 s，68℃退火 1 min，每執行一個循環后退火溫度降低2℃，72℃延伸1 min。35個標準循環為 94℃變性 30 s，58℃退火 45 s，72℃延伸45 s。完成以上循環以后，在72℃保持10 min，最后將PCR產物冷卻到室溫或者4℃。PCR擴 增 在Thermo-5020型PCR儀（Thermo Fisher Scienti fic. Int’l trade Co., Ltd.）上進行，擴增產物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產物送上海生工生物技術有限公司進行基因分型。

1.2.3 數據處理

將cpDNA測序的結果采用DnaSP 5.1軟件進行序列拼接，先剪去序列兩端不可靠的堿基序列和引物序列，然后再將正反兩個引物的序列進行比對，對序列進行編輯后獲得正反引物序列一致的DNA序列。通過MEGA 6.0軟件中的Clustal W 功能對所選材料的序列進行比對，適當手工校正，去除邊緣不準確的部分序列，整理以待分析，計算變異堿基數[17]。采用MP法(most parsimonious tree, MP)構建分子系統樹，對分支的可靠性評價使用靴帶值（bootstrap，1000次重復）分析，自展數值75% ～ 100%表示強支持率，50%～74%表示弱支持率，＜ 50%表示不支持[18]。使用DnaSP 5.1軟件對cpDNA序列進行單倍型數目(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、基因流(Nm) 、遺傳分化系數（FST）等的計算，并進行 Tajima’s D、Fu and Li’s D*、Fu and Li's F* 的 中 性 檢 驗 (Neutrality tests)[19]及群體動態擴張的失配分布分析(Mismatch Distribution Analysis)。 采 用 Network 4.2.0.1軟件基于最大簡約性原則的中間連接網法分析(median-joining networks)構建不同單倍型間的網絡關系圖[20]。利用Arelequin 3.11軟件中的 AMOVA( Analysis of Molecular Variance) 分析方法，基于cpDNA數據檢測群體間和群體內的遺傳變異[21]。

表2 cpDNA擴增體系Table 2 cpDNA ampli fication system

表3 PCR反應程序Table 3 PCR reaction procedure

表4 SSR擴增體系Table 4 SSR ampli fication system

使用 Popgen version 1.31 軟件計算各 SSR 標記和居群的位點數（na）、有效位點數（ne）、Shannon信息指數（I）、期望雜合度（He）、觀測雜合度（Ho）和Nei’s觀測雜合度（Nei），計算居群間遺傳一致度和遺傳距離，并進行群體間的基因流（Nm）和F統計（F-Statistics）計算。采用ntsys 2.10e軟件進行相似系數計算和聚類分析，利用Arelequin 3.11軟件中的AMOVA( Analysis of Molecular Variance) 分析方法 ( Excof fier et al., 2005)，基于 SSR 數據檢測群體間和群體內的遺傳變異。

2 結果分析

2.1 遺傳多樣性分析

2.1.1 cpDNA序列分析

3對引物測序在去除邊緣不可靠部分后，分 別 獲 得 634bp（1F-724R）、499 bp（rbclarev）、532 bp（rbcla-ajf634）的序列長度。序列的變異位點數量分別為5個、4個、4個。變異率從高到低分別是rbcla-rev（0.80%）、1F-724R（0.79%）和rbcla-ajf634（0.75%）。將3個序列對齊后依次拼接，共在4個居群中產生了5個單倍型（表5），單倍型數從多到少的居群依次為 WZK(4)、MS(3)、DX(3)和 CYS(2)。居群的Hd和π的大小順序不一致（表7），Hd最大的為居群WZK，最小的為居群CYS；π最大的為居群MS，最小的為居群DX。江華苦茶群體單倍型多樣性為Hd=0.726，核苷酸多樣性為π=0.00233，群體遺傳多樣性相對較高。

2.1.2 SSR分子標記

15對SSR引物中擴增并分型成功的有13對（表6），共擴增等位位點99個，平均每對引物7.62個，位點數最多的為A05和A10（13個），最少的是A08（4個）；有效位點最多的是A05（6.90個），最少的是A15（1.65個）；Shannon信息指數最大的為A05（2.19），最小的是A15（0.82）。4個居群中（表6），平均na、ne、He、Ho、Nei最大的分別為5.23、3.13、0.62、0.65和0.60，最低的分別是3.54、2.48、0.50、0.59和0.54。遺傳多樣性最高的是蔚竹口鄉居群（WZK），最低的是大錫鄉群體（DX）。江華苦茶群體的He、Ho和Nei分別為0.56、0.65和0.64，群體具有較高的遺傳多樣性（表7）。

2.2 資源間的親緣關系

表5 3個cpDNA序列對齊產生5個單倍型的變異位點Table 5 Variable sites of the aligned sequences of three chloroplast DNA fragments in the 5 haplotypes (H1–H5)

表6 13對引物的擴增結果Table 6 13 ampli fication results of primers

表7 江華苦茶不同群體的遺傳多樣性Table 7 Genetic diversity of different populations of Jianghua bitter tea

利用MP法構建了江華苦茶32份資源的系統發育樹（圖1），結果表明，對照豬婆茶單獨聚為一類（gene22），參試資源并沒有依照地理類群聚為不同的小類群。

利用DnaSP 5.1軟件對江華苦茶群體進行單倍型分析，分析結果表明，32個樣品被分為了5種單倍型，各單倍型所包含的種質情況見表8。其中數量最多的單倍型為H3，包含13份資源；其次是H4，有9份資源。對比單倍型和分子系統樹的結果可以發現，在系統樹當中H5和H4單倍型聚在了一起，單倍型H5和H4的親緣關系較近，而與其它單倍型的親緣關系較遠。

表8 基于cpDNA的江華苦茶單倍型的分布Table 8 Distribution of haplotypes of Jianghua bitter tea based on cpDNA

利用NETWORK構建葉綠體單倍型的網狀進化圖（圖2），H3處于整個網絡圖的中心節點上，包含的資源數量最多。一般認為古老單倍型多位于網絡圖的內部節點，而新衍生出的單倍型一般位于外部節點，H3可能屬于苦茶中比較原始的單倍型。以H3為基礎，分別按照三條演化路線獲得H1、H2、H4這三種單倍型，最后由H4演化出H5。

圖1 基于三個序列和最大簡約法（MP）構建的系統發育樹（圖中數字表示抽樣檢驗的自展百分比）Fig. 1 Phylogenetic tree based on three sequences and maximum parsimony (MP) (the figure shows the percentage of selfexpansion of the sampling test)

圖2 cpDNA5種單倍型網狀進化關系圖Fig. 2 cpDNA 5 haplotype network evolution diagram

圖3 ntsys對32個資源進行聚類分析構建的系統樹Fig. 3 ntsys system tree constructed by cluster analysis of 32 resources

采用ntsys 2.10e軟件對SSR分子標記數據進行處理，依照相似系數進行聚類分析見圖3（cpDNA實驗中22號的對照組在該實驗當中沒有使用，因此在該實驗當中22號之后的資源排號均前進一位）。按照聚類圖的結果，2號和14號、4號和13號相似性均高于0.95，而這兩組在單倍型分析當中也屬于同一單倍型，表明這兩組資源的親緣關系非常接近。而在32個樣品當中，還有兩個樣品（3號和27號）與其他樣品相似度均低于0.75，而在cpDNA的單倍型分析時，它們并沒有與其他樣品有明顯差異，考慮到cpDNA的母系遺傳特性，這兩個樣品的父本與其他樣品存在比較大的差異性。在0.85以上的區間，存在一個集合緊密，數量眾多的小集群，將該集群與cpDNA單倍型分析結合起來觀察時，發現該集群包括了H3（4、8、13、16）、H4（17、20、21、32）和 H5（31）三個處于一條演化鏈上的單倍型，屬于H3的四個資源相互之間關系最為密切，分別屬于H4和H5的21號資源和31號資源的遺傳相似度高達0.93，這個小集群是H3通過H4演化出H5在核基因上的體現。

2.3 居群遺傳結構分析

采用13個SSR標記對所有的位點進行連鎖不平衡檢驗，僅有3個位點是不連鎖的(P＞0.05)（表6），群體的近交系數FIS為正值（0.0344），而且一些位點顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡，表明群體的近交程度增加，純合子比例升高。群體間的遺傳分化系較小(FST=0.0971），分化程度較低，基因流較高（Nm=2.3254）。將SSR的檢測結果分別進行AMOVA分析，結果表明江華苦茶的遺傳變異主要出現在居群內（90.98%），居群間的遺傳差異很小（表9）。

表9 SSR實驗數據AMOVA分析結果（FST：0.09107）Table 9 AMOVA analysis results of SSR experimental data(FST： 0.09107)

利用DnaSP 5.1軟件對四個居群的遺傳結構分析表明，居群遺傳分化系數FST=0.26019( P＜0.0001)，基因流Nm=0.71，居群間的遺傳分化較大，基因流較弱。這個結果似乎表現了江華苦茶cpDNA的遺傳變異主要存在于居群間，而對cpDNA實驗數據采用AMOVA分析之后，得出的結果則是變異依然主要存在于居群內（表10），遺傳分化并不明顯。

表10 cpDNA實驗數據AMOVA分析結果（FST ： 0.10710）Table 10 AMOVA analysis results of cpDNA experimental data (FST： 0.10710)

2.4 中性檢驗與失配分析

利用DnaSP 5.1軟件對江華苦茶群體進行中性 檢 驗 ( Tajima，1989；Fuet al.，1993) ， 檢驗結果表明：參試資源的 Tajima’s D、Fu and Li’s D 和 Fu and Li’s F 均為正值，統計檢驗也不存在顯 著 性（Tajima's D： 0.65107，P＞ 0.10，Fu and Li’s D* test statistic： 1.04908，P＞ 0.10，Fu and Li’s F* test statistic： 1.08399，P＞ 0.10） 表 明 資源群體未經過擴張事件。對單倍型進行了失配分析，若群體經歷了擴張或瓶頸效應，將導致失配分布曲線呈現單峰; 若群體處于動態平衡或緩慢衰退狀態，沒有經歷擴張，則失配分布曲線為雙峰或多峰 ( Tajima，1989；Fu et al.，1993)；結果顯示，失配分布曲線呈多峰曲線，表明江華苦茶群體均沒有經歷擴張（圖4）。

圖4 失配分布曲線Fig. 4 Mismatch distribution curve

3 討論

3.1 江華苦茶群體遺傳多樣性

13對引物在32個江華苦茶資源中擴增的平均等位位點為7.62個，有效位點3.38，信息指數1.39，高于Zhao[22]等和Yao[23]等的研究結果，而與Fang[24]等和Wang[25]等的研究結果一致。這種豐富的等位位點與檢測資源的遺傳多樣性有關，也與SSR擴增產物的檢測技術等有關。本研究采用的熒光標記通過毛細管電泳進行檢測，其分辨率要遠高于傳統的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術，產生的等位位點就相對要多一些。

江華苦茶群體的Ho、He和Nei分別為0.56、0.65和0.64，高于Fang等和Yao 等的研究結果：Fang等采用58個SSR標記對185份中國茶樹栽培品種的遺傳多樣性進行了研究，Ho平均為0.340；Yao等采用96個SSR標記對中國14個省份共450份茶樹資源的研究，有13個省份的Nei小于本研究的0.64。cpDNA序列分析表明，江華苦茶群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均較高，具有較高的遺傳多樣性。

3.2 江華苦茶群體親緣關系

本研究對32種樣品的cpDNA通過MP法構建了系統發育樹，將樣品分為了四個大類，大類內部自展百分比均在80%以上，獲得了5種單倍型，對單倍型研究構建了網狀分析進化圖，發現了一個比較明顯的cpDNA演化線路（H3-H4-H5）。nSSR標記的相似度研究32個樣品之間的親緣關系，兩個樣品（3號、27號）與其他樣品相似度較遠，以及1個聚類比較緊密的小集群（4、8、13、16、17、20、21、31、32），綜合研究該集群內部相似度和樣品在cpDNA單倍型當中位置能夠很直觀的體現出這些樣品之間的親緣關系。

3.3 群體遺傳結構與基因流

基于SSR的江華苦茶群體的遺傳分化水平(FST=0.0971)，顯著小于基于cpDNA的遺傳分化(FST=0.26019 )，主要是因為核分子標記，基因流通過花粉和種子兩種方式傳播，而單親遺傳沒有重組的cpDNA基因流只能通過種子流來傳播，符合雙親遺傳的核基因組分子標記更傾向于減弱群體間的遺傳分化水平的觀點。從實驗數據結果來看，花粉流和種子流的比值要低于松屬植物、川梨、珙桐等異交植物，表現出了較強的種子流。茶組植物為異花授粉且自交不親和，江華群體的近交系數表現出正值(FIS=0.0344)不符合異交植物隨機交配原則，表明江華苦茶在遺傳演化過程中受到外來因素的影響，可能與人為的選擇、運輸和繁殖有關。