副結核分支桿菌MAP0862蛋白的表達及臨床應用

解曉莉 孫陽陽 程凱慧 楚會萌 張亮 王基隆 楊美 楊宏軍

摘要：本研究以腹瀉牛糞便基因組DNA為模板，擴增MAP0862基因，構建重組表達載體pET-30a（+）-MAP0862和pEGX-6P-1-MAP0862，通過原核表達系統表達His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白，經純化后制備兔源高免血清，建立ELISA特異性檢測方法，最后將純化蛋白和ELISA方法用于牛副結核病臨床樣品檢測，并對檢測數據進行分析。結果表明，以MAP0862蛋白為檢測原建立的ELISA檢測方法在臨床樣品檢測中具有較高的特異性和敏感性，說明MAP0862蛋白適用于副結核病抗體檢測。本研究建立的ELISA檢測方法可有效檢測臨床樣品中副結核病的感染。

關鍵詞：副結核病;MAP0862蛋白;ELISA;副結核分枝桿菌

中圖分類號：S852.61+8文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0111-06

Expression and Clinical Significance of Mycobacterium

avium subsp. paratuberculosis MAP0862 Protein

Xie Xiaoli， Sun Yangyang， Cheng Kaihui， Chu Huimeng，

Zhang Liang， Wang Jilong， Yang Mei， Yang Hongjun

（Dairy Cattle Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250131，China）

AbstractThe MAP0862 gene was cloned from fecal genome of diarrhea cattles. The pET-320（+）-MAP0862 and pEGX-6P-1-MAP0862 expression vector were constructed to express the His-MAP0862 and GST-MAP0862 proteins. The recombinant proteins were used to obtain immune serum after purification， and the ELISA method was established. The MAP0862 protein and ELISA method were used to detect paratuberculosis. The results showed that there was highly specificity and sensitivity in ELISA test using MAP0862 protein as stimulator， so it was confirmed that MAP0862 protein was optimal for antibody detection of paratuberlosis. The ELISA method established based on MAP0862 protein could detect paratuberculosis effectively in clinical samples.

KeywordsParatuberculosis; MAP0862 protein; ELISA; Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis （MAP）

副結核病（paratuberculosis）是一種由副結核分支桿菌即禽分枝桿菌副結核亞種（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis，MAP）引起的以慢性增生性、頑固性腸炎和進行性消瘦為特征的傳染病[1，2]，具有強烈的傳染性，而且可垂直傳播。副結核分枝桿菌主要感染反芻動物，如牛、山羊、綿羊和鹿等，也可感染部分野生非反芻獸[3]。牛在一歲前最易感染MAP，但直到2～5歲才會出現臨床癥狀，導致頑固性腹瀉、消瘦、產奶量和繁殖力嚴重下降至喪失，最終導致淘汰。另外，有報道指出，牛副結核分枝桿菌與人的局限性腸炎以及HIV和其他免疫缺陷病的感染有關[4-9]。

副結核分支桿菌感染后機體的免疫應答在感染初期以細胞免疫為主，皮內變態反應檢出率高，但隨著病情的發展，細胞免疫應答逐漸減弱而體液免疫應答逐漸增強[10-12]。MAP對牛的持續性感染可以分為兩個階段，首先是MAP感染宿主進入腸道，然后進入巨噬細胞[13]，并在巨噬細胞內生存和增殖[14]，從而導致MAP的持續性感染。而MAP特異性基因編碼的蛋白是影響MAP在巨噬細胞內定殖和發揮致病力的重要因素[15，16]。另外，由于MAP特異性抗原可以區別于環境中的分枝桿菌尤其是禽分枝桿菌，所以其在副結核病的診斷方面具有良好的敏感性和特異性。因此，眾多學者開展了MAP特異性抗原的分析工作，并鑒定出一些具有診斷價值的抗原[17，18]，如MAP0862、MAP2154c等。

MAP0862蛋白是MAP特異性抗原，在副結核診斷中具有良好的特異性和靈敏性。本研究從成母牛的腹瀉糞便中提取基因組DNA，擴增克隆MAP0862基因，并體外表達純化相關蛋白，建立ELISA和早期檢測方法，應用于牛副結核病的臨床診斷，以評價其臨床診斷應用價值。

1材料與方法

1.1質粒、菌株及主要試劑

pMD-20T克隆載體、感受態DH5α、BL21（DE3）、蛋白質Marker均購自北京TransGen Biotech;pET-30a（+）和pEGX-6P-1由本實驗室保存;限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ及DNA Marker均購于大連寶生物工程有限公司;Anti-His mAb和Anti-GST mAb及羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所;DNA回收試劑盒和質粒抽提試劑盒均購自北京TianGen Biotech;His-Bind Purification Kit和GST-tag Protein Purification Kit購自Novagen公司;試驗用雌兔購于山東省農業科學院種兔實驗基地。其余試劑為國產分析純。

1.2副結核分支桿菌基因擴增模板的選取

取少量腹瀉牛糞便于無菌離心管內，加入無菌SW，振蕩混勻，10 000 r/min離心3 min，棄上清，用糞便基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。

根據GenBank中IS900序列（CP005928）設計引物，由北京華大生物科技有限公司合成，序列為：F：5′-CTGGCTACCAAACTCCCGA-3′，R：5′-GAACTCAGCGCCCAGGAT-3′，預計擴增目的片段長度為314 bp，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的總DNA作為MAP0862基因擴增的模板。

1.3MAP0862基因的克隆

根據GenBank中MAP0862基因序列（NC_002944.2）設計引物，由北京華大生物科技有限公司合成，引物序列為：Ps1：5′-CAGGATCCATGCGCTTCGTAAACGGCAA-3′（BamHⅠ），Pa1：5′-ATGAATTCTCAGGCGCGCCACAGATTT-3′（EcoRⅠ），預計擴增目的片段長度為1 083 bp。參照文獻[12]方法進行RT-PCR、連接、轉化、篩選、酶切和測序鑒定，將重組質粒命名為pMD-20T-MAP0862。利用NCBI中的BLAST進行MAP0862氨基酸序列比對。

1.4重組MAP0862蛋白的表達與鑒定

將重組質粒pMD-20T-MAP0862和pET-30a（+）、pEGX-6P-1同時使用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，連接、轉化宿主菌BL21（DE3）中構建重組菌（pET-30a（+）-MAP0862/BL21）和（pEGX-6P-1-MAP0862/BL21）。同上方法進行篩選、酶切和測序鑒定。取鑒定正確的菌液培養，經IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）30℃誘導后，超聲波裂解離心取上清。使用His-Bind Purification Kit和GST-tag Protein Purification Kit純化His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白，使用超濾柱對純化的蛋白進行除鹽濃縮。參照文獻[12]的方法以Anti-His mAb和Anti-GST mAb （1∶2 000）為一抗，羊抗鼠IgG-HRP（1：4 000）為二抗，ECL顯色，進行Western blot鑒定。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）對純化蛋白濃度進行測定。

1.5MAP0862蛋白高免血清的制備

免疫前對家兔耳緣靜脈采血，收集血清，以備后續檢測使用。以純化的His-MAP0862蛋白為免疫原，與等體積的弗氏完全佐劑充分混合均勻，對家兔（2 kg/只，雌性）進行皮下多點免疫，免疫劑量為1.0 mg/只。分別于首次免疫兩周和四周后，將His-MAP0862蛋白和弗氏不完全佐劑等體積混合免疫家兔。于第三次免疫兩周后，收集少量血清進行抗體水平分析，抗體大量產生后處死家兔，收集血清。

1.6MAP0862抗體檢測ELISA方法的建立

使用包被液（Na2CO3/NaHCO3緩沖液，pH值9.6）稀釋GST-MAP0862蛋白分別為0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL作為包被抗原，100 μL/孔，置于4℃過夜包被;用PBST洗板，然后加入10%小牛血清，200 μL/孔封閉2 h;用PBST洗板，然后加入1∶100、1∶200、1∶400到1∶102 400倍比稀釋的血清，以PBS為空白對照，100 μL/孔，37℃孵育2 h;用PBST洗板，加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體（用PBST進行1∶5 000稀釋），100 μL/孔，37℃孵育1 h;用PBST洗板，加入TMB顯色液，100 μL/孔，避光反應10～15 min后，加入終止液（2 mol/L H2SO4）50μL/孔，讀取吸光值（OD?492）。經多次調整抗原包被濃度和血清稀釋度后，確定GST-MAP0862抗原的最佳包被濃度，建立MAP0862抗體檢測方法。并以建立的ELISA方法對高免血清抗體效價進行評定。

1.7MAP0862在臨床檢測上的應用

1.7.1ELISA方法檢測牛群中副結核病的感染情況采集牛頸靜脈或尾靜脈血于促凝管中，收集血清。用愛德士的牛副結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒和上述建立的MAP0862間接ELISA檢測方法，分別對收集的血清進行ELISA檢測。具體步驟參照試劑盒說明書和上述ELISA檢測方法建立步驟。整理檢測結果，對兩種檢測方法在副結核病檢測中的特異性和敏感性進行比對分析。

1.7.2皮膚變態反應檢測牛群中副結核病的早期感染情況將牛在頸夾保定的基礎上進行頭部安全固定，充分暴露出頸部，在頸部相聚10 cm以上的部位選取兩點分別作為副結核菌素和MAP0862蛋白的注射點，剃毛。然后用電子游標卡尺測量注射點的皮膚厚度，記錄數據。消毒后，在兩個注射點分別皮內注入0.1 mL的副結核菌素（0.5 mg/mL）和MAP0862蛋白（0.05 mg/mL，高純蛋白使用濃度為副結核菌素的1/10）。注射72 h后測量注射點的皮膚厚度，記錄數據。分析注射前后皮膚厚度差，判斷牛只副結核分支桿菌感染狀態。對比結果，分析MAP0862蛋白和副結核菌素作為副結核病檢測刺激原的特異性和敏感性。

1.7.3IFN-γ釋放試驗檢測牛群中副結核病的早期感染情況無菌采集牛頸靜脈或尾靜脈血5 mL于含肝素鋰或肝素鈉的抗凝管中，輕輕顛倒混勻防止部分血液發生凝血。無菌條件下將血液分裝至3個無菌離心管內，1.5 mL/支，分別加入100 μL PBS，副結核菌素（200 IU）和MAP0862蛋白（20 μg/mL），充分混勻，37℃孵育16～24 h。500×g離心10 min后，將上層血漿轉移到新的離心管中。根據Prionics公司的Bovigam牛結核分枝桿菌γ干擾素ELISA檢測試劑盒說明書進行接下來的ELISA檢測，讀取OD?450的吸光度，分析牛群的感染情況及兩種刺激原在此方法應用中的特異性及敏感性。

1.7.4MAP0862蛋白在副結核病診斷中的應用前景分析匯總數據，分析MAP0862蛋白和副結核菌素在副結核病診斷中的結果符合率及各刺激原在檢測中的特異性及敏感性。

2結果與分析

2.1MAP0862基因的克隆和重組質粒構建

以臨床上篩選到的陽性糞便樣品全基因組DNA為模板，成功擴增1 083 bp的MAP0862基因（圖1），經測序鑒定正確無突變。

MAP0862重組質粒經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，得到1 083 bp的目的片段（圖2），BLAST比對結果顯示該基因與NCBI公布的相應序列同源性均為100%，重組質粒均構建正確。

2.2MAP0862蛋白的表達與鑒定

將原核表達產物經SDS-PAGE與Western blot（圖3）分析顯示，His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白均已表達，且大小與預期大小（分別為44 kD和64 kD）一致。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測得純化的His-MAP0862和GST-MAP0862蛋白濃度分別為1.5 mg/mL和1.0mg/mL。

2.3MAP0862間接ELISA檢測方法的建立

根據不同包被濃度下空白對照和陰性值以及不同濃度抗體與抗原的反應情況，最終確定MAP0862蛋白的包被濃度為2 μg/mL，樣品OD?450≥0.25且樣品OD?450/陰性OD?450≥2時認為抗體陽性，否則為陰性。利用建立的ELISA方法，測定制備的兔源多抗的效價達1∶106（圖4）。結果表明MAP0862具有良好的免疫原性和反應原性。

2.4MAP0862蛋白在臨床診斷中的應用

2.4.1ELISA方法檢測牛群中副結核病的感染情況收集274份牛血清進行牛副結核病抗體ELISA檢測，結果顯示，愛德士的牛副結核分枝桿菌抗體檢測試劑盒檢測出抗體陽性59頭份，MAP0862抗原檢測出抗體陽性48頭份，其中一頭愛德士試劑盒檢測為可疑（列入陰性群）的牛只MAP0862蛋白檢測抗體陽性。兩種檢測方法的符合率達95.26%。具體分析結果見表1。

2.4.2皮膚變態反應檢測牛群中副結核病的早期感染情況皮膚變態反應試驗共檢測牛只100頭份，根據《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T 1084-2010》和OIE 2014年5月頒布的副結核病皮試檢測判斷標準：皮厚差>2 mm即判為副結核陽性，≤2 mm則為副結核陰性。結果顯示副結核菌素作為檢測原檢測陽性11頭份，MAP0862蛋白作為檢測原檢測陽性7頭份。兩者整體符合率達82.00%，但陽性符合率為0。具體分析結果見表2。

2.4.3IFN-γ釋放試驗檢測牛群中副結核病的早期感染情況從上述檢測的100頭份牛只中采取51頭份奶牛抗凝血進行IFN-γ釋放試驗檢測，結果顯示，副結核菌素作為刺激劑檢測陽性15頭份，MAP0862蛋白作為刺激劑檢測陽性15頭份。兩者的整體符合率僅為68.63%。具體分析結果見表3。

2.4.4MAP0862蛋白在副結核診斷中的應用前景分析將皮膚變態反應和IFN-γ釋放試驗結果進行對比分析，結果顯示以副結核菌素作為檢測原，兩種方法的符合率為62.75%;而以MAP0862蛋白作為檢測原，兩種方法的符合率達73.53%。說明在副結核病的早期診斷中MAP0862蛋白作為檢測原具有較高的特異性，但相較于副結核菌素的高陽性檢出率，MAP0862蛋白在副結核病的早期檢測中的敏感性可能相對較低。而在抗體檢測中，MAP0862蛋白作為檢測原，與商品化的試劑盒檢測結果的符合率較高，且其作為單一抗原，在檢測的特異性上可能更有優勢，因此MAP0862蛋白更適合應用于副結核病的抗體檢測。

3討論與結論

副結核病是由副結核分枝桿菌引起的反芻獸的慢性消化道疾病，以頑固性腹瀉、漸進性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺襞為特征。本病呈世界性流行，無明顯季節性，主要呈散發，有時可呈地方性流行。副結核病的主要診斷方法為以副結核提純菌素或禽結核提純菌素為刺激原或檢測原的皮試檢測和ELISA抗體檢測，但由于副結核分枝桿菌與結核分枝桿菌復合群內的主要致病菌牛分枝桿菌和結核分枝桿菌的同源性較高，相互之間干擾較大，降低了檢測特異性，易引起檢測的假陽性。

MAP0862蛋白為副結核分枝桿菌特異性抗原，其可對副結核病進行特異性檢測，不受其他分枝桿菌的影響。本研究利用大腸桿菌表達系統進行MAP0862蛋白的體外表達獲得高純MAP0862蛋白，制備高免血清并建立了ELISA特異性檢測方法。利用此方法對臨床樣品進行檢測，結果顯示，本方法與商品化愛德士試劑盒檢測結果的符合率達95.26%，表明此方法具有較好的特異性與敏感性;且其作為單一檢測原，與愛德士試劑盒中以副結核菌素為檢測原相比，具有更高的特異性。

以MAP0862蛋白作為刺激原通過皮膚變態反應和IFN-γ釋放試驗對臨床樣品進行檢測，結果顯示，在皮膚變態反應中，MAP0862蛋白與副結核菌素作為刺激原的檢測結果的符合率為82.00%;在IFN-γ釋放試驗中，MAP0862蛋白與副結核菌素作為刺激原的檢測結果的符合率為68.63%。但MAP0862蛋白在兩種方法的檢測中有更高的符合率，表明MAP0862蛋白在副結核病的早期檢測中有更高的特異性，但其敏感性較低。

本研究結果表明，MAP0862蛋白在副結核病的抗體ELISA檢測中具有較好的特異性與敏感性，可用于副結核病的血清學抗體檢測。根據這一結果推測MAP0862蛋白主要在以體液免疫為主的副結核病感染中后期參與副結核病感染。本研究為副結核病診斷方法的研究提供了借鑒依據與研究方向，有利于副結核病診斷方法研究的進一步開展。

參考文獻：

[1]Olsen I， Sigurgardottir G， Jonne D B. Paratuberculosis with special reference to cattle. A review[J]. Vet. Q.， 200?24：12-28.

[2]Whittington R J， Sergeant E S. Progress towards understanding the spread， detection and control of Mycobactrium avium subsp. paratuberculosis in animal population[J]. Aust. Vet. J.， 200?79：267-278.

[3]Motiwala A S， Amonsin A， Strother M， et al. Molecular epidemiology of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolates recovered from wild animal species[J]. J. Clin. Microbiol.， 2004， 42：1703-1712.

[4]Chacon O， Bermudez L E， Barletta R G. Johnes disease， inflammatory bowel disease， and Mycobacterium paratuberculosis[J]. Annu. Rev. Microbiol.， 2004， 58：329-363.

[5]Davis W C， Madsen-Bouterse S A. Crohns disease and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis： the need for a study is long overdue[J]. Vet. Immunol. Immunopathol.， 201?145：1-6.

[6]Paccagnini D， Sieswerda L， Rosu V， et al. Linking chronic infection and autoimmune disease： Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis， SLC11A1 polymorphisms and type-1 diabetes mellitus[J]. PLoS One， 2009， 4：e7109.

[7]Sisto M， Cucci L， DAmore M， et al. Proposing a relationship between Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection and Hashimotos thyroiditis[J]. Scand. J. Infect. Dis.， 2010， 42：787-790.

[8]Arru G， Caggiu E， Paulus K， et al. Is there a role for Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Parkinsons disease？[J]. J. Neuroimmunol.， 2016， 293：86-90.

[9]Niegowska M， Delitala A， Pes G M， et al. Increased seroreactivity to proinsulin and homologous mycobacterial peptides in latent autommune diabetes in adults[J]. PLoS One， 2017， 12：e0176584.

[10]Coussens P M. Model for immune responses to Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in cattle[J]. Infect Immun.， 2004， 72：3089-3096.

[11]Stabel J P. Transition in immune response to Mycobacterium paratuberculosis[J]. Vet. Microbiol.， 2000， 77： 465-473.

[12]Koo H C， Park Y H， Hamilton M J. Analysis of the immune response to Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in experimentally infected calves[J]. Infect Immun.， 2004， 72： 6870-6883.

[13]Arsenault R J， Maattanen P， Daigle J， et al. From mouth to macrophage： mechanism of innate immune subversion by Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis[J]. Vet. Res.， 2014， 45（54）：1-15.

[14]Kuehnel M P， Goethe R， Habermann A， et al. Characterization of the intracellular survival of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis： phagosomal PH and fusogenicity in J774 macrophages compared with other mycobacteria[J]. Cell Microbiol.， 200?3（8）：551-556.

[15]Bannantine J P， Barletta R G， Stabel J R， et al. Application of the genome sequence to address concerns that Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis might be a foodborne pathogen[J]. Foodborne Pathog. Dis.， 2004， 1：3-15.

[16]Wang J， Pritchard J R， Kreitmann L， et al. Disruption of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-specific genes impairs in vivo fitness[J]. BMC Genomics， 2014， 15：415.

[17]Bannantine J P， Paustain M L， Waters W R， et al. Profiling bovine antibody responses to Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection by using protein arrays[J]. Infect. Immun.， 2008， 76（2）：739-749.

[18]Paustain M L， Amonsin A， Kapur V， et al. Characterzation of novel coding sequences specific to Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis： implications for diagnosis of Johnes disease[J]. J. Clin. Microbiol.， 2004， 42（6）：2675-2681.