基于UGT1A1酶抑制探討何首烏中順(反)式二苯乙烯苷體外肝微粒體中潛在毒性作用△

汪祺，王亞丹，文海若，馬雙成

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

何首烏為蓼科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb.的干燥塊根。生何首烏可解毒，消癰，潤腸通便；制首烏具有補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨之功效[1]。近年來國內外有關何首烏肝損傷病例報道逐年增多，何首烏導致的肝損傷占全部中藥肝損害病例的5.69%，位居第一[2-7]。

何首烏所含化學成分眾多，主要為二苯乙烯苷類、蒽醌類、蒽酮類等成分[8]。

本課題組前期已針對毒性焦點成分蒽醌等進行了初步研究，發現大黃素甲醚，大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷等成分具有較強肝毒性風險。本文重點研究對象為(制)何首烏中另一類重要成分——二苯乙烯苷類[9-10]。反式二苯乙烯苷是生首烏和制首烏中主要化學成分，在何首烏藥材中可占到約1%～7%；而反式二苯乙烯苷結構不穩定，在何首烏晾曬、提取、干燥和貯存等生產炮制環節均可能經光轉化而形成順式二苯乙烯苷[11]。近期有學者指出，何首烏中反式二苯乙烯苷的代謝差異可能為何首烏致肝損傷的重要原因[10]。有研究使用人重組UGT同工酶證明反式二苯乙烯苷主要經由Ⅱ相代謝酶介導代謝外排出體外，UGT代謝能力依次為：UGT1A1>UGT1A9>UGT1A7>UGT1A10>UGT2B7>UGT1A8[12]。此外，順式二苯乙烯苷同樣被證明具有肝細胞毒作用[12]?？梢姺词?、順式二苯乙烯苷均具有潛在肝毒性風險，有必要對其毒性機制作進一步研究。

膽紅素是人體內一種非常重要的內源性物質，它是血紅素的代謝產物，主要經由UDP-葡萄糖醛酸轉移酶1A1(UGT1A1)代謝轉化為水溶性結合型葡萄糖醛酸結合物，外排至膽汁中。UGT1A1酶受到外源性物質抑制，可導致體內膽紅素無法轉化成結合型膽紅素或轉化量降低，繼而可引發膽紅素代謝障礙，并誘發膽紅素在肝細胞和血液內蓄積，最終引起肝臟毒性反應[3]。因此，膽紅素的升高是判定肝損害的重要生物標志物。而何首烏導致的肝損傷患者具有相似的臨床表征，即膽紅素水平顯著升高，平均總膽紅素濃度可達生理濃度的8～79倍[13]。由于UGT1A1酶是膽紅素的唯一代謝酶，同時又是反式二苯乙烯苷的主要代謝酶，因此，考察反式、順式二苯乙烯苷對UGT1A1的代謝影響，可有效預測其潛在致肝毒性風險。

由于肝內代謝主要包含Ⅰ相和Ⅱ相代謝兩個重要環節，因此本文采用體外肝微粒體孵育方法，首先啟動Ⅱ相代謝，考察順式、反式二苯乙烯苷原型對UGT1A1酶的影響，闡明原型成分的肝毒性風險；其次，為了更加真實地模擬體內肝代謝，同時啟動Ⅰ相和Ⅱ相代謝，將Ⅰ相代謝產物的因素涵蓋進去，進一步闡明二者的潛在毒性作用。最終，本實驗將從代謝角度闡明引起何首烏肝損傷的可能機制及潛在毒性物質。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；節能型智能恒溫槽SDC-6(寧波新芝生物科技股份有限公司)，METTLER TOLEDO AE240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，Thermo 17R型高速低溫離心機(日本Thermo公司)。

1.2 材料與試劑

RLM(大鼠肝微粒體)購自美國BD Gentest公司；維生素C(Vc，純度≥98%)、磷酸鉀(純度≥98%)、氯化鎂(純度≥98%)、氧化型輔酶II(NADPNa2)(純度≥98%)、三羥甲基氨基甲烷(Tris，純度≥98%)、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉(G-6-P)(純度≥98%)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶V(G-6-PDH)(純度≥98%)均購自百靈威科技有限公司，丙甲菌素(純度≥98%)、葡萄糖二酸單內酯(純度≥98%)、二甲基亞砜(DMSO，純度≥98%)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA，純度≥98%)均購自Sigma Aldrich公司。順式二苯乙烯苷(批號：16091802，質量分數98%)、反式二苯乙烯苷(批號：16081506，質量分數98%)均購于成都普菲德生物技術有限公司。膽紅素(批號：100077-201206，質量分數99.3%)購自中國食品藥品檢定研究院；甲酸、鹽酸均為分析純(北京化學試劑廠)，乙腈、甲醇均為色譜純(Fisher公司)。

2 方法與結果

2.1 UPLC色譜條件

分析柱：Acquity UPLC HSS C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；預柱：Acquity UPLC HSS C18VanGuard Pre-column(5 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～2.1 min，40%→75% A；2.1～4.2 min，75%→95% A；4.2～8.0 min，95% A；8.0～8.5 min，95%→40% A；8.5～12.5 min，40% A)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：450 nm；進樣量：1 μL[14-15]。

2.2 溶液的配制

2.2.1 Tris-HCl緩沖液的配制 精密稱取121.1 g Tris于1000 mL容量瓶，加入去離子水800 mL，濃HCl調節pH=7.4，定容即得。

2.2.2 UDPGA再生系統的配制 精密稱取丙甲菌素、氯化鎂、UDPGA、葡糖二酸單內酯適量，用Tris-HCl緩沖液溶解，使含葡糖二酸單內酯5 mmol·L-1、氯化鎂5 mmol·L-1、丙甲菌素25 μg·mL-1、UDPGA5 mmol·L-1，即得。

2.2.3 還原型輔酶II(NADPH)生成系統的配制 精密稱取NADPNa2、G-6-PDH、G-6-P、MgCl2適量，置100 mL容量瓶中，加超純水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得體系中含有1 mmol·L-1NADPNa2、20 mmol·L-1G-6-P、2 U·L-1G-6-PDH、20 mmol·L-1MgCl2，現用現配[16-18]。

2.3 Ⅱ相反應溫孵體系

以新鮮配制的UDPGA再生系統稀釋RLM，肝微粒體體系蛋白終濃度為0.5 mg·mL-1，分別加入不同濃度的順式、反式二苯乙烯苷及UGT1A1酶底物膽紅素DMSO溶液(體系終體積200 μL，其中DMSO總用量不超過1%)。將體系置于37 ℃恒溫水浴預孵育3 min，加入UDPGA(使含UDPGA終濃度為5 mmol·L-1)啟動反應。反應15 min后加入600 μL冰乙腈-甲醇(體積比為2∶1，含Vc濃度為200 μmol·L-1)終止反應，沉淀蛋白，取上清液1 μL進行UPLC液相測定。每個樣本重復3次[16-18]。

2.4 Ⅰ、Ⅱ兩相反應溫孵體系

以新鮮配制的UDPGA再生系統稀釋RLM，肝微粒體體系蛋白終濃度為0.5 mg·mL-1，分別加入不同濃度順式、反式二苯乙烯苷及膽紅素DMSO溶液(體系終體積200 μL，其中DMSO總用量不超過1%)。將體系置于37 ℃恒溫水浴預孵育3 min，加入UDPGA和NADPH再生系統(使含UDPGA終濃度為5 mmol·L-1)啟動兩相代謝反應。反應15 min后加入600 μL冰乙腈-甲醇，(體積比為2∶1，含Vc濃度為200 μmol·L-1)終止反應，沉淀蛋白，取上清液1 μL進行UPLC液相測定。每個樣本重復3次[16-18]。

2.5 順式、反式二苯乙烯苷對UGT1A1酶的抑制作用考察

本部分實驗采用RLM孵育體系，考察順式、反式二苯乙烯苷對UGT1A1酶的抑制作用，首先僅啟動Ⅱ相代謝反應，考察待測物未經Ⅰ相代謝的原型成分對Ⅱ相代謝酶UGT1A1的作用；其次，同時啟動兩相代謝，將代謝產物的因素考察進去，通過比較不同通路代謝后的差異，可進一步闡明其潛在肝毒性風險。

2.5.1 啟動Ⅱ相反應后考察順式、反式二苯乙烯苷對UGT1A1酶的抑制作用 按上述方法，分別以UGT1A1酶底物膽紅素代謝物生成量對底物濃度作圖，以米氏方程雙倒數作圖法測定Vmax、Km，并以slop繪圖法求得抑制常數Ki；考察順式、反式二苯乙烯苷在RLM中對UGT1A1酶的抑制情況。結果見表1和圖1。由實驗結果可以看出：當僅啟動Ⅱ相反應時，順式、反式二苯乙烯苷均以原型形式直接作用于UGT1A1酶，兩個單體分別表現出中等抑制和弱抑制作用，抑制類型均為競爭型抑制，即二者可與UGT1A1底物膽紅素產生競爭性代謝，從而降低膽紅素代謝效率，且順式二苯乙烯苷抑制作用更強，提示原型成分對UGT1A1酶具有抑制作用，存在引發膽紅素原型堆積繼而產生肝毒性的風險。

2.5.2 同時啟動Ⅰ、Ⅱ相反應后考察順式、反式二苯乙烯苷對UGT1A1酶的抑制作用 按上述方法，分別以膽紅素代謝產物生成量對膽紅素濃度作圖，以米氏方程雙倒數作圖法測定Vmax、Km，并以slop繪圖法求得抑制常數Ki；考察順式、反式二苯乙烯苷在RLM中對UGT1A1酶的抑制情況，結果見圖2和表2。由實驗結果可以看出：當同時啟動Ⅰ、Ⅱ兩相反應時，待測物同時經歷兩相代謝反應，待測物以Ⅰ相代謝產物或原型形式作用于UGT1A1酶，兩個待測單體對UGT1A1酶的抑制作用均消失，提示兩個單體存在Ⅰ相代謝過程，并且其Ⅰ相代謝產物對UGT1A1酶無抑制作用，Ⅰ相代謝降低了順式、反式二苯乙烯苷的肝毒性風險。

表1 啟動Ⅱ相代謝后待測物對UGT1A1酶的抑制作用考察(n=3)

注：Ki<1 μmol·L-1，強抑制；Ki>50 μmol·L-1，弱抑制[19]。

注：A.加入順式二苯乙烯苷后UGT1A1酶雙倒數方程；B.加入順式二苯乙烯苷后UGT1A1酶slop圖；C.加入反式二苯乙烯苷后UGT1A1酶雙倒數方程；D.加入反式二苯乙烯苷后UGT1A1酶slop圖。圖1 啟動Ⅱ相代謝反應待測藥物對UGT1A1酶動力學參數的影響

注：A.加入順式二苯乙烯苷后UGT1A1酶雙倒數方程；B.加入順式二苯乙烯苷后UGT1A1酶slop圖；C.加入反式二苯乙烯苷后UGT1A1酶雙倒數方程；D.加入反式二苯乙烯苷后UGT1A1酶slop圖。圖2 啟動Ⅰ、Ⅱ相代謝反應待測藥物對UGT1A1酶動力學參數的影響

表2 啟動Ⅰ、Ⅱ相代謝后待測物對UGT1A1酶的抑制作用考察(n=3)

注：Ki<1 μmol·L-1，強抑制；Ki>50 μmol·L-1，弱抑制[17]。

3 小結與討論

當前已有大量有關何首烏肝毒性作用機制和毒性物質的研究。綜合現有文獻報道發現，何首烏所致肝損傷與肝臟代謝酶缺陷、氧化還原循環、能量代謝脂質代謝、影響細胞膜運載膽鹽受體及引起內質網應激導致的細胞損傷等因素有關[20-22]。本文試圖從代謝酶角度出發進一步闡明何首烏所致肝損傷的可能機制。

何首烏毒性成分的研究結果提示制首烏毒性低于生首烏，其中經加工炮制后反式二苯乙烯苷降低至原來含量的20%，成分含量變化最為顯著[23]。研究人員已針對該成分開展了多方面的研究。張樂等[11]提出何首烏中反式二苯乙烯苷不穩定，在貯藏過程中可轉化為順式二苯乙烯苷，而順式二苯乙烯苷被證明與何首烏所致的特異質肝損傷相關。此外，李娜等[12]使用藥物代謝酶抑制劑來考察代謝因素對反式二苯乙烯苷潛在的肝損傷作用，發現反式二苯乙烯苷主要經由UGT介導進行Ⅱ相代謝，通過抑制藥物Ⅱ相代謝酶來增加反式二苯乙烯苷潛在的肝損傷風險。本研究從代謝酶角度展開研究，以UGT1A1酶介導的膽紅素代謝受阻可引發肝毒性風險為出發點，通過體外方法測定順式、反式二苯乙烯苷對Ⅱ相代謝酶UGT1A1的抑制作用，從而推測其肝毒性風險。首先啟動Ⅱ相代謝反應，考察順式、反式二苯乙烯苷未經Ⅰ相代謝的原型成分對Ⅱ相代謝酶UGT1A1的作用，結果提示，原型成分對UGT1A1酶存在抑制作用，且順式二苯乙烯苷抑制作用大于反式二苯乙烯苷，表現為中強抑制。考慮到某些藥物可能同時經過Ⅰ相、Ⅱ相代謝，且這兩個通路可能會是競爭性的平行反應，又或者Ⅰ、Ⅱ兩相代謝物可分別對Ⅰ、Ⅱ兩相代謝通路產生促進或抑制作用，故單獨監測NADPH或者UDPGA依賴的通路都可能會導致一定的偏差，不能代表體內的真實生物轉化情況，應同時啟動兩相代謝反應。本研究結果提示，順式、反式二苯乙烯苷抑制作用均消失，提示二者存在Ⅰ相代謝過程，同時該代謝過程產生的代謝產物可有效降其肝毒性風險。

綜上，本研究嘗試從二相代謝酶角度出發，闡釋何首烏所致肝毒性的作用機制及其可能的潛在肝毒性物質。實驗結果初步證明何首烏中順式、反式二苯乙烯苷經由Ⅰ相代謝后，對Ⅱ相代謝酶UGT1A1抑制作用消失，肝毒性風險降低。