苦參實毒性成分分析△

宿美鳳，雒曉梅，常曉燕，王小明，孫虹，李壯壯，石鉞*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

苦參Sophoraflavescens為豆科槐屬植物，傳統中藥苦參的藥用部位為根。近年來，隨著中醫藥事業的快速發展，中藥非藥用部位引起了越來越多的研究者的關注。本實驗室整理發現，苦參實為豆科槐屬植物苦參的種子。《唐本草》正名為苦參實，至《本草綱目》標明異名苦參子，可為藥用，性味苦寒，功能與主治：明目，健胃與驅蟲，善治急性菌痢，大便秘結等[1]。苦參實曾被收錄于1977版吉林省藥品標準[2]，《中醫驗方集錦》和《中醫皮膚病學簡編》記載苦參實用于治療肉疙瘩和青年扁平疣[3-4]，此外還有民間報道：王國栓將苦參實干燥粉碎裝入膠囊，臨床治療扁桃體炎患者41例，痢疾濕熱型18例，陰道滴蟲20例，均在服藥3～10 d治愈[5]。近年來對苦參實的研究較少，文獻報道苦參實中含有高含量的生物堿類物質和豐富的脂肪酸類物質，并且苦參實脂肪酸提取物具有良好的抗氧化作用[6]。但是有文獻報道，一名男性患者由于痔瘡反復發作，自服苦參子仁20粒，當晚發生神經系統中毒癥狀，經搶救康復[7]。因此本試驗通過苦參實的單次給藥毒性試驗對苦參實毒性成分進行初步研究，為苦參實今后的開發利用提供依據。

1 材料與試劑

藥材：苦參實購于內蒙古赤峰，經中國醫學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定為豆科槐屬植物苦參Sophoraflavescens的成熟種子。

實驗動物：SPF級 Wistar 大鼠，雌雄各半，體質量180±20 g，購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號 SCXK(京)2016-0006，飼養于中國醫學科學院藥用植物研究所 SPF 動物實驗中心(20～25 ℃，濕度40%～60%)，開展實驗前適應性飼喂一周，自由飲水進食。

對照品：苦參堿(批號CHB-K-008)、氧化苦參堿(批號CHB-Y-053)、槐定堿(批號CHB-H-062)購自成都克洛瑪生物科技有限公司，槐果堿(批號MUST-17061205)購自成都曼斯特生物科技有限公司，氧化槐果堿(批號Z18S6B3547)購自上海源葉科技有限公司，N-甲基金雀花堿(批號J-032-161216)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。HPLC測定對照品純度均>98%。

試劑：95%乙醇購于北京化工廠。HPLC級乙腈購于Honeywell Burdick & Jackson公司。色譜級甲酸購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。色譜級醋酸胺購于ROE SCIENTIFIC INC公司。娃哈哈純凈水購于杭州娃哈哈集團有限公司。001×7型陽離子交換樹脂購于天津南開大學化工廠。

對照品的配制：分別精密稱取苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、槐果堿、氧化槐果堿、N-甲基金雀花堿配制濃度為1 mg·mL-1的對照品儲配液，備用。

儀器：Agilent 1100 高效液相色譜儀，ES-1201-P 電子天平稱(1200 g，長沙湘平科技發展公司)，Mettler Toledo AB135-S 型分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，KQ-250DE 超聲波清洗儀(中國)，Eppendorf 移液器(德國)。

2 方法與結果

2.1 苦參實總提取物的制備

苦參實適度粉碎(過20目篩)，95%乙醇水熱回流提取三次，每次1 h，過濾收集濾液，合并三次濾液，旋轉蒸發儀旋干溶劑，真空干燥既得苦參實提取物，備用。

2.2 苦參實提取物不同組分的制備

陽離子交換樹脂按照說明書進行預處理，處理好的樹脂濕法裝柱(柱徑∶柱高=1∶8)，經預實驗結果得，取100 g苦參實提取物用酸水溶解少量多次，至酸水液無碘化鉍鉀反應，酸水上樣吸附1～2 h，4倍柱體積去離子水洗脫至洗脫液近中性。再用14倍柱體積的5%氨性乙醇洗脫至洗脫液濃縮后無碘化鉍鉀反應。分別將水洗部分和氨性乙醇洗脫部分減壓回收溶劑得到相應的組分。

2.3 苦參實總提物單次給藥毒性試驗

表1 苦參實總提物單次給藥毒性預實驗結果

表2 苦參實總提物單次給藥毒性試驗結果

表3 苦參實總提物單次給藥毒性試驗雄性動物體質量的變化 g

表4 苦參實總提物單次給藥毒性試驗對雌性動物體質量的影響 g

2.4 經HPLC鑒定苦參實不同組分

2.4.1 供試品的配制 稱取2.1，2.2項下苦參實總提物及不同組分各自溶于50%甲醇水溶液中配制成10 mg·mL-1，渦旋超聲后，12 000 r·min-1離心10 min，取10 μL經HPLC分析。

2.4.2 對照品的配制 取材料與試劑項下對照品母液，混合配制成混標。

2.4.3 HPLC條件 液相條件：采用Phenomenex Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)和 10 mmol·L-1醋酸銨水溶液(B)；梯度洗脫條件：95%～83% B(0～6 min)，83% B(6～14 min)，83%～70% B(14～19 min)，70%～68% B(19～32 min)，68%～65%(32～35 min)，65%～0(35～40 min)，0～95%(40～43min)，95%(43～50 min)；流速：1 mL·min-1；進樣體積：10 μL；自動進樣器溫度：室溫；色譜柱溫度：30 ℃；檢測波長：225 nm。

2.4.4 樣品分析 各組分色譜圖見圖1。由圖可知陽離子交換樹脂水洗部分為非生物堿部分，氨性乙醇洗脫部分與混標色譜信息相匹配，所以氨性乙醇洗脫部分為生物堿部分。

注：A.混標；B.苦參實總提物；C.生物堿部分；D.非生物堿部分。圖1 苦參實不同組分HPLC色譜圖

2.5 苦參實不同組分的單次給藥毒性試驗

苦參實不同組分單次給藥毒性試驗結果見表5，體質量變化見表6及表7。結果發現生物堿組與總提物組出現動物死亡，并且動物出現死亡的現象、癥狀以及體質量變化均與2.3項下描述相似，死亡動物進行大體解剖無肉眼可見病變。而非生物堿組未出現死亡，無任何中毒癥狀，并且非生物堿組體質量增長與溶劑對照組相似。生物堿組與總提物組在給藥后1～3 d體質量增長明顯緩慢而非生物堿組給藥后1～3 d體質量增長正常。雖然生物堿組動物死亡率低于總提物組，可以說明生物堿類物質是引起苦參實急性毒性的主要原因。

表5 苦參實不同組分單次給藥毒性試驗結果

3 討論

通過本試驗可知苦參實有毒，研究者通過對苦參實化學成分的文獻檢索分析，通過陽離子交換樹脂分離苦參實中的生物堿部分和非生物堿部分，并通過HPLC 驗證陽離子交換樹脂可以將生物堿和非生物堿良好分離。

由試驗結果可知苦參實的主要毒性成分為生物堿類物質。

根據本試驗所觀察到的急性毒性反應癥狀，參照藥物單次給藥毒性研究指導原則中的一般觀察與指征，苦參實提取物引起的驚厥，肌肉震顫和強直性痙攣等毒性癥狀為神經毒性癥狀。并且中毒癥狀與文獻報道苦參、苦參堿和氧化苦參堿的急性毒性癥狀相似[9-11]。翁澤斌等[12]報道的山西產苦參種子生物堿類化學成分定性定量分析表明苦參實中含有大量生物堿類物質，氧化苦參堿含量最高，本實驗室也得到相似結論(待發表)。在中藥化學成分的研究過程中發現生物堿類物質具有良好的藥理活性，同時如果大量使用也會產生毒性。現代研究表明，苦參中所含的生物堿類物質是其主要的有效成分[13-14]。因此，也驗證了本試驗通過苦參實總提物單次給藥毒性試驗以及苦參實的不同組分的單次給藥毒性試驗得到的結果，引起苦參實急性毒性的主要原因為生物堿類。但是從動物死亡數可知，生物堿組引起死亡的動物數低于總提物組，其產生原因可能是由于動物個體差異、生物堿種類含量不同以及生物堿累積作用或者苦參實中含有其他非生物堿物質對于苦參實中生物堿引起的毒性具有協同作用，也可能是其他原因，還有待深入研究。

表6 苦參實不同組分單次給藥毒性試驗對雄性動物體質量的影響 g

表7 苦參實不同組分單次給藥毒性試驗對雌性動物體質量的影響 g