桔梗莖葉總皂苷的提取工藝△

蔣征奎，李曉，王學方

1.鄭州大學附屬腫瘤醫院(河南省腫瘤醫院)，河南 鄭州 450000；2.河南省植物天然產物開發工程技術研究中心，河南 鄭州 450002

桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，是我國傳統的四十種大宗中藥材之一，最早載于《神農本草經》。其性平，味苦、辛，歸肺經，具有宣肺利咽、祛痰排膿之功效，臨床常用于咳嗽痰多、咽痛、音啞、胸悶不暢等[1]。桔梗中含有大量的三萜皂苷，生物活性研究表明，桔梗皂苷具有祛痰、抗氧化、保肝、降糖、抑制脂肪吸收、抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用[2-4]。

桔梗為多年生草本植物，一般種植2～3年后收獲地下根，而桔梗莖葉作為非入藥部位多廢棄不用，造成資源浪費。有研究表明，桔梗莖葉中總皂苷含量高于桔梗根中總皂苷的含量[5]，與桔梗根相比，桔梗莖葉的祛痰作用在一定范圍內隨著濃度的增加明顯增強[6]；桔梗莖葉總皂苷具有明顯的抗腫瘤作用，對免疫器官也有一定的保護作用[7]；另外，桔梗莖葉還具有一定的抗炎活性[8]。目前對桔梗莖葉皂苷的提取未見研究報道，本實驗以桔梗莖葉為原料，采用正交設計優化其最佳提取工藝，并進一步采用大孔吸附樹脂技術優化了桔梗莖葉皂苷分離純化工藝，旨在為桔梗莖葉的綜合開發利用與桔梗莖葉皂苷的深入研究提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀、AUW220D十萬分之一天平(日本島津)；Alltech ELSD2000ES蒸發光檢測器(美國奧泰)；JJ5000A型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)；HGJR-01紅外加熱儀(河南中良科學儀器有限公司)；LGJ-12低溫冷凍干燥儀(北京松源華興科技發展有限公司)；SB-1100旋轉蒸發儀(東京理化)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

桔梗皂苷D對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111851-201406，純度96.2%)；D101、AB-8、HPD750、NKA-9大孔吸附樹脂(天津市光復精細化工研究所)；柱層層析硅膠(100～200目)(青島海洋化工廠分廠)；甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水、蒸餾水；其他試劑均為分析純。

桔梗莖葉，采自河南三門峽盧氏縣，經河南大學張保國教授鑒定為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.的莖葉。

2 方法與結果

2.1 桔梗總皂苷與桔梗皂苷D的測定

2.1.1 桔梗莖葉總皂苷的測定 取桔梗莖葉提取物2.0 g，精密稱定，加水50 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取4次，每次用量分別為100、50、50、50 mL，合并正丁醇液，減壓干燥，得桔梗莖葉總皂苷提取物[9]，精密稱定，計算總皂苷含量。

(1)

2.1.2 桔梗皂苷D的含量測定 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水(25∶75)為流動相；蒸發光散射檢測器檢測。理論板數按桔梗皂苷D峰計算應不低于30 000。

對照品溶液的制備：精密稱定桔梗皂苷D對照品18.75 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，溶解后定容至刻度，即得對照品溶液，其中桔梗皂苷D的質量濃度為0.75 mg·mL-1。

供試品溶液的制備：精密稱取桔梗莖葉總皂苷提取物0.2 g，至5 mL容量瓶中，加甲醇溶解后，再加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

含量測定：分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數方程計算，即得桔梗皂苷D含量。見圖1～2。

圖1 桔梗皂苷D的HPLC圖

圖2 供試品中桔梗皂苷D的HPLC圖

2.1.3 方法學考察 線性關系考察：精密稱取一定量的桔梗皂苷D對照品，制成桔梗皂苷D的質量濃度分別為0.1、0.25、0.5、0.75、10.0 mg·mL-1的對照品溶液，以桔梗皂苷D進樣量為橫坐標，以峰面積為縱坐標得其回歸方程：Y=52 308.35X+10 234.54，r=0.998 9，桔梗皂苷在1.5～15 ug線性關系良好。

精密度試驗：精密稱取桔梗莖葉總皂苷提取物0.2 g，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，并按上述色譜條件，吸取供試品溶液10 uL，重復進樣6次，記錄峰面積，計算桔梗皂苷D的含量。結果桔梗皂苷D的平均質量分數為2.12 mg·g-1，峰面積RSD為1.35%，表明該方法精密度良好。

穩定性試驗：供試品溶液分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，吸取該供試品溶液10 uL，進樣測定，記錄峰面積，計算桔梗皂苷D的含量。結果桔梗皂苷D的平均質量分數為2.10 mg·g-1，峰面積RSD為1.82%，表明供試品在24 h內穩定。

加樣回收率：取已知含量的供試品溶液6份，每份加入實際質量濃度為0.75 mg·mL-1的桔梗皂苷D溶液2 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，吸取每份供試品溶液10 uL，進樣測定，記錄峰面積，并計算加標回收率及其RSD。計算結果為平均回收率96.50%，RSD為1.95%，說明該方法準確性良好。

2.2 正交試驗優選桔梗莖葉總皂苷的提取工藝

預試驗中對提取桔梗莖葉的溶媒、溫度、次數等可能影響桔梗莖葉總皂苷提取的因素進行了單因素試驗考察，提取溶劑考察了30%、45%、60%、75%的乙醇與水，結果桔梗總皂苷的提取率差異不大，考慮到經濟環保因素，選擇水為提取溶劑；提取溫度考察了60、70、80、90、100 ℃(提取溫度采用紅外加熱爐的溫度傳感器進行控溫，控溫精度為±2 ℃)，結果隨著溫度的增加桔梗總皂苷的轉移率逐漸增加，所以選擇80、90、100 ℃ 3個溫度水平進行試驗；提取次數考察了1、2、3、4、5次，結果提取3次后，桔梗總皂苷的提取率幾乎不增加，所以選擇1、2、3次進行下一步的正交試驗。

根據預試驗結果，結合莖葉類中藥材的提取，以桔梗莖葉總皂苷含量、桔梗皂苷D的含量與轉移率為指標，以提取溫度(A)、加水量(B)、提取時間(C)和提取次數(D)為考察因素，采用四因素三水平正交試驗優化桔梗莖葉總皂苷的提取工藝[10]，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

稱取桔梗干燥莖葉，每份30 g，按照表2進行試驗，提取液減壓濃縮至干，稱質量，計算桔梗莖葉提取物收率，按照2.1方法測定桔梗莖葉提取物中總皂苷的含量、桔梗皂苷D的含量，并計算桔梗皂苷D的轉移率[11]。

表2 正交試驗結果

(2)

因正交表中無空列以計算試驗誤差項，每次試驗均各重復3次。

表3 總皂苷含量方差分析結果

表4 桔梗皂苷D的含量方差分析結果

表5 桔梗皂苷D轉移率的方差分析結果

由正交試驗結果與方差分析結果可知，在考察的因素水平范圍內，對總皂苷含量的影響大小為D>B>C>A，其中提取次數影響較大，且有顯著性影響，其次為溶劑用量、提取時間、提取溫度，最佳提取條件為A3B3C3D2，即100 ℃，12倍量水，每次2 h，提取2次；對桔梗皂苷D含量的影響大小為D>A>B>C，其中提取次數影響最大，且有顯著性影響，其次為提取溫度、溶劑用量、提取時間，最佳提取條件為A3B1C1D2，即100 ℃，8倍量水，每次1 h，提取2次；對桔梗皂苷D轉移率的影響大小為D>A>C>B，其中提取次數影響最大，且有顯著性影響，其次為提取溫度、提取時間、溶劑用量，最佳提取條件為A3B1C2D2，即100 ℃，8倍量水，每次1.5 h，提取2次；綜上，結合成本和提取效率，確定優選出最佳方案為A3B2C2D2即100 ℃，10倍量水，每次1.5 h，提取2次。

2.3 提取驗證試驗

稱取桔梗干燥莖葉3份，每份100 g，按照優選的工藝條件，即10倍量的水提取2次，提取溫度100 ℃，每次1.5 h，提取液減壓濃縮至干，稱重，計算桔梗莖葉提取物收率，并測定干膏中總皂苷的含量、桔梗皂苷D的含量，并計算桔梗皂苷D的轉移率，結果見表6。由結果可知，平均浸膏得率為41.4%，桔梗莖葉總皂苷的質量分數為13.16%，桔梗皂苷D的質量分數為2.08 mg·g-1，轉移率為66.08%，說明該提取工藝穩定、可靠。

表6 提取驗證試驗結果

2.4 桔梗莖葉總皂苷的純化

經過提取得到的桔梗莖葉提取物中含有大量的雜質，很大程度上影響了對藥物療效的評價、理化參數的測定等更深層次的研究，為了達到去除雜質、富集有效成分的目的，采用大孔吸附樹脂對桔梗莖葉總皂苷進行純化。

2.4.1 樣品溶液的制備 按照已優選出的最佳提取工藝制備藥液，并測定桔梗莖葉總皂苷的含量。

2.4.2 樹脂的預處理 為除去樹脂中的部分雜質，試驗前先將大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡，充分溶脹24 h，濕法裝柱(徑高比1∶7)，先用95%的乙醇清洗，直至洗出液加等量的蒸餾水不產生白色渾濁為止，再用蒸餾水沖洗，至無醇味且水液澄清，則預處理完畢，備用。

2.4.3 大孔吸附樹脂的篩選[12]

2.4.3.1 采用動態-吸附試驗篩選樹脂 準確稱取已處理好的4種大孔樹脂，分別為D101、AB-8、HPD750、NKA-9各50 g，蒸餾水濕法上柱(徑高比1∶7)。取經離心處理的桔梗莖葉水提取液100 mL上柱，質量濃度為每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g，以1.0 mL·min-1的流速吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測定桔梗莖葉總皂苷的量，并計算各樹脂的動態吸附率，結果見表7。

動態吸附率(%)=(上柱液中總皂苷量-流出液中總皂苷量)/上柱液中總皂苷量×100%

(3)

2.4.3.2 動態-解吸試驗篩選樹脂 將2.4.3.1中充分吸附后的樹脂用蒸餾水洗脫至無色，改用70%乙醇洗脫至無色，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法測定桔梗莖葉總皂苷的量，并計算各樹脂的動態解吸率。結果見表7。

(4)

表7 不同型號大孔吸附樹脂的篩選試驗結果 %

從工藝角度出發，適宜的吸附樹脂應具有良好的可逆性，即良好的吸附性能與解吸性能。根據實驗結果可以看出，雖然AB-8的吸附能力沒有D101的強，但是其解吸能力高于D101很多。綜合評價，分離純化桔梗莖葉總皂苷的最佳樹脂可選擇AB-8。

2.4.4 AB-8大孔吸附樹脂純化工藝參數

2.4.4.1 吸附因素的考察 上樣量對吸附效果的考察：稱取6份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)25、50、75、100、125、150 mL，以1.0 mL·min-1的流速進行動態吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測定桔梗莖葉總皂苷的量，并計算不同上樣量的吸附率，結果見圖3。根據圖3可知，隨著上樣量的增加，樹脂的吸附率先上升后下降。上樣量偏高，會造成樹脂的過飽和不吸附，處理量小，上樣量偏低，造成樹脂的不完全利用，浪費資源。故50 g樹脂上樣100 mL藥液比較適宜，則確定上樣量為桔梗莖葉提取物量與樹脂用量比為0.8∶1。

藥液濃度對吸附效果的考察：稱取6份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經離心處理的桔梗莖葉水提取液100 mL，藥液質量濃度分別為每mL含桔梗莖葉提取物0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g，以1.0 mL·min-1的流速進行動態吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測定桔梗莖葉總皂苷的量，并計算不同藥液濃度的吸附率，結果見圖4。根據圖4可知，吸附量隨藥液濃度的增大而增加，但吸附殘液中桔梗莖葉總皂苷的含量也隨藥液濃度的增大而增加，從而引起成分的流失。藥液濃度越大，吸附的雜質含量也越高，不利于總皂苷的分離純化。因此，藥液濃度選擇每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g為最佳，總皂苷的吸附量可達95%以上。

圖3 上樣量對吸附效果的考察結果

圖4 藥液質量濃度對吸附效果的考察結果

流速對吸附效果的考察：稱取4份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)100 mL，分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL·min-1的流速進行動態吸附，吸附3 h后，收集過柱液，減壓濃縮至干，按上述2.1方法，測定桔梗莖葉總皂苷的量，并計算不同流速的吸附率，結果見圖5。由圖5可知，0.5、1.0 mL·min-1的流速的吸附率變化不大，1.5、2.0 mL·min-1的流速的吸附率明顯下降。由于流速過慢，耗時增加，效率降低。綜合各因素考慮，控制流速為1.0 mL·min-1為宜。

圖5 流速對吸附效果的考察結果

2.4.4.2 洗脫條件的優化 洗脫液濃度的考察：稱取5份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)100 mL，控制流速為1.0 mL·min-1。先用蒸餾水將已吸附飽和的樹脂柱洗至流出液接近于無色，再分別用35%、55%、75%、95%乙醇洗脫樹脂柱，收集洗脫液，減壓濃縮至干，計算桔梗莖葉總皂苷提取物的收率，按上述2.1方法，測定桔梗莖葉總皂苷和桔梗皂苷D的含量，結果見表8。75%、95%乙醇的洗脫效果最好，55%乙醇洗脫次之，35%的洗脫能力最弱。其中，75%乙醇洗脫部分總皂苷和桔梗皂苷D的含量較95%乙醇高，說明75%乙醇可以將樣品中的皂苷類成分全部洗脫下來，且雜質比95%乙醇少，因此選用75%乙醇作為洗脫劑。

表8 洗脫液濃度的考察結果

洗脫液體積的考察：稱取5份已處理好的AB-8樹脂50 g，濕法裝柱(徑高比1∶7)，量取經離心處理的桔梗莖葉水提取液(每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g)100 mL，控制流速為1.0 mL·min-1。先用蒸餾水將已吸附飽和的樹脂柱洗至流出液接近于無色，再分別用3、4、5、6、7、8 BV的75%乙醇洗脫樹脂柱，收集洗脫液，減壓濃縮至干，計算桔梗莖葉總皂苷提取物的收率，按上述2.1方法，測定桔梗莖葉總皂苷和桔梗皂苷D的含量，結果見表9。5 BV的75%乙醇洗脫液就可以把樹脂上80%以上的總皂苷解吸下來，故確定洗脫液為5 BV的75%乙醇。

表9 洗脫液體積的考察結果

綜合以上試驗結果分析，優化桔梗莖葉總皂苷純化工藝參數：最佳工藝提取藥液離心后濃縮至1.0 g生藥/mL，通過AB-8型大孔吸附樹脂，上樣量為桔梗莖葉提取物量：樹脂用量=0.8∶1，流速為1.0 mL·min-1，用5 BV的75%乙醇洗脫。

2.5 桔梗莖葉總皂苷提取純化工藝驗證試驗

稱取桔梗干燥莖葉3份，每份100 g，加10倍量的水提取2次，提取溫度100 ℃，每次1.5 h，提取液減壓濃縮至每mL含桔梗莖葉提取物0.4 g，離心后上清液上AB-8型大孔吸附樹脂，上樣量為桔梗莖葉提取物量∶樹脂用量=0.8∶1，流速1.0 mL·min-1，先用蒸餾水將已吸附飽和的樹脂柱洗至流出液接近于無色，用5 BV75%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓干燥，計算桔梗莖葉總皂苷提取物的收率，測定桔梗莖葉總皂苷和桔梗皂苷D的含量，結果見表10。由結果可知，桔梗莖葉總皂苷的平均得率為9.06%，總皂苷的平均質量分數為48.18%，桔梗皂苷D的平均質量分數為9.18 mg·g-1，說明該提取工藝穩定、可行。

表10 純化驗證試驗結果

3 討論

桔梗莖葉為中藥桔梗的非藥用部位，本研究以桔梗莖葉為原料，以桔梗莖葉總皂苷含量、桔梗皂苷D含量為指標，采用正交設計優化其最佳提取工藝，并進一步采用大孔吸附樹脂技術優化了桔梗莖葉皂苷的分離純化工藝，所得桔梗莖葉總皂苷的質量分數為48.18%，桔梗皂苷D的質量分數為9.18 mg·g-1，較大孔吸附樹脂純化前樣品中總皂苷和桔梗皂苷D的含量提高5倍以上，為桔梗莖葉總皂苷進一步的藥效及機制研究奠定了基礎，也為合理利用桔梗資源與綜合開發利用提供參考。