炒決明子主成分分析及其多肽降壓活性

陳佩瑤，張月圓，王惠蕓，陳祖君，王靈芝*

1.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488；2.中國醫學科學院 阜外醫院SICU，北京 100037

決明子為豆科植物決明CassiaobtusifoliaL.或小決明CassiatoraL.的干燥成熟種子，主產于浙江、安徽、廣東及四川等地[1]。決明子性微寒，味咸、苦、甘，歸大腸、腎、肝經；決明子具有藥用、茶飲開發、養生開發價值，是中藥臨床和中藥保健的重要藥材[2]。決明子炒制品寒瀉之性緩和，有平肝養腎、降血壓、降血脂等功效[3]。

高血壓是心血管疾病的主要危險因素之一，嚴重威脅著人類健康[4]。血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)是一線降壓藥物，但其不良反應明顯，會引起口干、非劑量依賴性咳嗽、味覺失常、腎衰、先天性異常、低風險的血管神經性水腫甚至死亡[5]，因此，尋找新型ACEI已成為近幾年的熱點。與ACEI相比，食源性降壓肽具有安全性高，不良反應小[6-7]等特點，目前已從動植物中獲得大量ACE抑制肽，Li等[8]從泥鰍蛋白水解物中獲得四肽Ala-His-Leu-Leu，可使SHR(原發性高血壓大鼠)血壓降低22.1 mmHg。Lunow等[9]發現，雞蛋清溶菌酶的酶解產物有很強的ACE抑制活性，獲得了2個二肽Ala-Try和Try-Try，IC50分別是20、68 μmol·L-1；Jang等[10]發現，小平菇水提物能降低SHR血壓50 mmHg，并從中分離到Arg-Leu-Pro-Ser-Glu-Phe-Asp-Leu-Ser-Ala-Phe-Leu-Arg-Ala和Arg-Leu-Ser-Gly-Gln-Thr-Ile-Glu-Val-Thr-Ser-Glu-Tyr-Leu-Phe-Arg-His。近據報道，薏苡仁[11]、麥芽[12]、蜈蚣[13]、醋豆[14-15]等中藥中均富含ACE抑制肽。決明子為中醫臨床常用降壓藥物，決明子作為降壓片主要藥材收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第四冊。《銀海精微》記載：決明散主治肝腎陰虧、風熱上擾、眼見黑花不散。肖伍華等[16]觀察決明子臨床治療高血壓病例，有效病例為92%。決明子30 g研末沖服，治療高血壓有效率達93.02%[17]。決明子蛋白質經內消化后產生的多肽組分是否具有降壓活性尚未有相關報道，故本文對炒決明子蛋白質組成及其酶解物ACE抑制活性進行研究，為該藥材降壓肽的獲得及其藥效物質基礎闡釋提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

BT 224S型電子分析天平(德國Sartorius公司)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；TGL-20M型臺式高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)；DHG-9053A 型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；XW-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ-300 VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SR-JX-4-13型高溫電阻爐(北京市永光明醫療儀器廠)；Epoch酶標儀(美國Bio-Tek公司)；WXG-4型旋光儀(上海申光儀器儀表有限公司)；PowerPac 3000電泳儀(美國Bio-Rad公司)；TS-8脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；全自動旋光儀(美國魯道夫公司)；Waters高效液相色譜儀。

1.2 試藥

血管緊張素轉化酶(ACE，批號9015-82-1，美國Sigma公司)；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL，批號1001510772，美國Sigma公司)；胃蛋白酶(批號01535535，美國Sigma公司)；其他試劑均為分析純。

炒決明子CassiatoraL.，批號17042403，產地廣西，購于北京同仁堂藥店，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為豆科植物小決明子CassiatoraL.清炒制得。

2 方法

2.1 炒決明子主成分分析

根據2015版《中華人民共和國藥典》，分別對炒決明子進行蛋白質含量、粗脂肪含量、水分和灰分的含量進行測定[1]。

2.1.1 蛋白質含量測定 精密稱取樣品，經濃硫酸消化后，在堿性條件下將銨鹽轉化為氨氣，氨氣隨水蒸氣蒸餾出來并被過量的硼酸溶液吸收，最后用質量濃度為0.01 mol·L-1的鹽酸滴定。計算公式：

(1)

其中V2、V1分別為滴定樣品和滴定空白消耗鹽酸平均數(mL)，C為酸標準液濃度(mol·L-1)，14為氮的原子量，6.25為系數，W為樣品克數。

2.1.2 粗脂肪含量測定 精密稱取樣品，加入已干燥至恒重的濾紙筒內，石油醚回流提取樣品粗脂肪8 h后，烘干樣品稱質量。計算公式：

(2)

m0為濾紙筒質量，單位為克；m1為提取前樣品和濾紙總質量，單位為克；m2為提取后樣品和濾紙筒總質量，單位為克。

2.1.3 水分含量測定 精密稱取供試品，在干燥至恒重的稱量瓶中平鋪均勻，精密稱定后，開啟瓶蓋在105 ℃下干燥5 h，放冷30 min，精密稱定，再于上述溫度干燥1 h，再次放冷和稱質量。根據減失的質量，計算供試品的含水量(%)。

2.1.4 灰分測定 精密稱取供試品，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質量，緩緩熾熱，至完全碳化時，逐漸升高溫度至500～600 ℃，使完全灰化并至恒質量，根據殘渣質量，計算供試品總灰分含量。

2.1.5 淀粉含量測定 精密稱取(2.5±0.05)g(m1)待測樣品，用稀鹽酸水解，在澄清和過濾后用旋光法測定總旋光度α1[18]。精密稱取(5±0.1)g(m2)待測樣品，用體積分數為40%的乙醇溶液萃取出可溶性糖和相對分子量低的多糖，濾液處理同上，測定旋光度值α2。兩種方法測量結果的差值，乘以系數，即為樣品的淀粉含量。計算公式：

(3)

α1為樣品總旋光度值，單位為度；α2為樣品中醇溶物質旋光度值，單位為度；m1為總測定樣品的質量，單位為克；m2為醇溶測定樣品的質量，單位為克；w1為測定樣品中干物質的質量分數；300為豆類淀粉在589.3 nm波長測得的比旋度，單位為度。

2.2 決明子蛋白質的提取

2.2.1 總蛋白的提取 炒決明子粉碎后過40目篩子，石油醚脫脂，真空干燥，采用50 mmol·L-1KH2PO4-NaOH(pH=8.0)緩沖液抽提蛋白，固液比1∶10(w∶v)，4 ℃磁力攪拌10 h，5000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入硫酸銨至55%飽和度，離心收集沉淀，緩沖液溶解蛋白沉淀，雙蒸水低溫透析(截留分子量3.5 KDa)24 h，期間換水數次，冷凍干燥后備用[19]。Bicinchoninic acid(BCA)法[20]測定蛋白含量。

2.2.2 決明子蛋白質組分的抽提 采用順序抽提法提取決明子清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[21]。炒決明子經粉碎機粉碎后過40目篩，脫脂，依次采用雙蒸水、0.5 mol·L-1氯化鈉溶液、70%乙醇溶液(0.5%乙酸鈉)、0.012 5 mol·L-1硼酸鈉緩沖液(1%十二烷基硫酸鈉、2%β-巰基乙醇)振蕩抽提60 min，10 000 r·min-1離心15 min，重復2次，分別提取清、球、醇溶及谷蛋白組分。雙蒸水低溫透析24 h(截留分子量3.5 KDa)，期間換水數次，然后冷凍干燥備用。

2.3 SDS-PAGE

采用垂直板不連續體系[22]，將樣品溶液與上樣緩沖液混合，100 ℃變性5 min，冰浴10 min，取適量樣品上樣。設置濃縮膠恒定電壓60 V，分離膠恒定電壓120 V。考馬斯亮藍R-250染色3 h，置脫色液(水∶95%乙醇∶冰醋酸=17∶2∶1)中室溫脫色，直至蛋白條帶清晰，背景干凈。

2.4 決明子小分子量多肽的制備

采用蛋白酶水解法制備決明子小分子多肽組分[23]。精確稱取炒決明子原藥材粉末、清、球、醇溶和谷蛋白凍干粉及蛋白提取殘渣用胃蛋白酶水解，水解條件為：底物濃度2%，酶與底物濃度比1∶10，pH=2.0，溫度37 ℃，時間48 h。水解后將樣品95 ℃變性5 min，冰浴10 min，再經8000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清液備用。

將備用的上清液轉移至超濾管(截留分子量3 KD)5000 r·min-14 ℃離心30 min，收集濾過液，制備小分子肽(≤3 KD)[11，24]，冷凍干燥后備用。采用Lowry法測定多肽濃度[25]

2.5 ACE抑制活性的測定

采用高效液相色譜法進行樣品ACE抑制活性測定[23]。用硼酸緩沖液(0.1 mol·L-1硼酸，0.3 mol·L-1NaCl，pH=8.3)溶解樣品。反應體系為：樣品溶液10 μL、ACE(2 mU)20 μL和HHL(2 mM))20 μL。

采用C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，TIANHE)分析樣品。洗脫條件：流動相A∶流動相B=25∶75[A：乙腈，B：超純水(含0.05% TFA，v/v)]，液相流速為1 mL·min-1，柱溫箱的柱溫為30 ℃，樣品的進樣量為10 μL，檢測器于228 nm下進行檢測，根據HA峰面積計算ACE抑制率。

ACE抑制率(%)=(A-B)/A×100%

(4)

A為空白對照組的HA峰面積，B為樣品組的HA峰面積。

3 結果

3.1 決明子主要成分分析

決明子主要成分含量如下。淀粉含量最高，占總質量的(46.44±0.66)%，蛋白質含量為(22.08±0.04)%，粗脂肪為(14.07±0.14)%，水分和灰分含量分別為(6.67±0.06)%和(5.45±0.04)%，符合2015版《中華人民共和國藥典》相關規定。

3.2 炒決明子蛋白組成分析

采用BCA法對水溶性總蛋白含量進行測定。水溶性蛋白占總蛋白含量的(4.52±0.17)%，含量較低。故采用順序抽提法提取蛋白進行蛋白組分的分析。

采用凱氏定氮法對決明子清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白組分進行含量測定，結果見表1。清蛋白占總蛋白含量的(14.55±0.01)%，球蛋白占(14.87±0.03)%，醇溶蛋白和谷蛋白分別占(2.67±0.01)%和(21.04±0.03)%，殘渣中仍剩余46.89%蛋白質。

四類蛋白組分經SDS-PAGE凝膠電泳后，得到的電泳圖譜見圖1。清蛋白條帶豐富，主要分布在14、24、30、58 KD；球蛋白條帶主要分布在14、20、30、40～50 KD；谷蛋白條帶在24、30、62、100 KD均有分布。醇溶蛋白由于含量低，未檢測出明顯條帶。

表1 炒決明子蛋白質組分分布 %

注：1.球蛋白；2.清蛋白；3.標準分子量；4.谷蛋白；5.醇溶蛋白。圖1 炒決明子蛋白組分SDS-PAGE圖譜

3.3 決明子小分子肽ACE抑制活性分析

采用高效液相法測定各蛋白源多肽組分的ACE抑制活性，見圖2～3。圖2a為對照品HHL的色譜圖，保留時間為11.0 min。空白對照組(硼酸緩沖液)沒有ACE抑制活性(見圖2b)；清、球、醇溶蛋白及谷蛋白酶解產物(3 KD，0.01 mg·mL-1)具有不同程度的ACE抑制活性。球蛋白酶解物的ACE抑制率為(38.44±1.54)%(見圖2c)，活性最高。清蛋白酶解物和醇溶蛋白酶解物的抑制率分別為(29.39±1.60)%(見圖2e)和(30.48±1.91)%(見圖2f)，谷蛋白酶解物抑制率為(4.30±0.86)%(見圖2g)。陽性藥卡托普利(2×10-9mol·L-1)的抑制率為(46.47±1.08)%(見圖2d)。殘渣因含有大量硬蛋白，水解物所得ACE抑制率為(17.59±2.70)%。

注：a.HHL；b.空白；c.球蛋白源小分子肽；d.卡托普利；e.清蛋白源小分子肽；f.醇溶蛋白源小分子肽；g.谷蛋白源小分子肽。圖2 樣品的RP-HPLC圖

注：*代表不同樣品間差異有統計學意義；*#代表該兩組樣品與只標*的其他樣品的差異有統計學意義，標有*#兩組樣品間差異無統計學意義(P<0.05)。圖3 各多肽組分ACE抑制率

4 討論

決明子中水溶性和脂溶性苷類化合物具有降低SD大鼠血壓和心率作用，且其功能的發揮與隨體網狀結構有關[26-27]。決明子水提物具有降低DBA/2J青光眼大鼠眼內壓的作用，同時前房水乳酸脫氫酶水平降低[28]。李續娥等[29]報道，決明子蛋白質可顯著降低血壓，降壓效果與決明子低聚糖、蒽醌苷和復方利血平無顯著差異，然而持續性不如后兩者。本研究通過順序抽提法依次提取決明子四類蛋白組分，進而采用胃蛋白酶法獲得小分子肽，結果表明，球蛋白酶解產物具有良好的ACE抑制活性。后續將采用不同的色譜方法對其進一步分離純化，有望從中獲得高效中藥源降壓藥物，也為該藥的臨床用藥提供了新的理論指導。