新胃乃安片中4種異黃酮成分的含量測定及一測多評法的建立△

梁小銀，嚴萍，詹若挺，陳蔚文

廣州中醫藥大學 中藥資源科學與工程研究中心/嶺南中藥資源教育部重點實驗室(廣州中醫藥大學)/國家中成藥技術研究中心南藥研發實驗室，廣東 廣州 510006

新胃乃安片由黃芪、三七、紅參、人工牛黃等組成，是基于藥效導向及保持原處方不變的原則，對胃乃安膠囊進行二次開發制成的片劑。該產品具有補氣健脾、活血止痛的功能，常用于治療胃及十二指腸潰瘍、慢性胃炎等消化道黏膜損傷性疾病[1-2]。在前期的研究中，本課題組發現其作用機制可能與抗氧化、清除自由基、促進多胺合成有關[1]。此外，本課題組還進行了黃芪、紅參、三七以及人工牛黃的薄層色譜鑒別和黃芪甲苷含量測定方法的研究[3]。黃芪作為君藥對新胃乃安片的療效發揮具有重要的作用，異黃酮類成分是黃芪的主要活性成分及質量控制指標成分[4-5]，具有抗氧化，清除自由基的作用[6]。蔡海霞等[7]采用一測多評法同時測定黃芪藥材中芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷及毛蕊異黃酮苷的含量，但中藥復方制劑中黃芪異黃酮成分的一測多評含量測定方法尚未見報道。本實驗以芒柄花素、毛蕊異黃酮、芒柄花苷及毛蕊異黃酮苷為研究對象，建立了一測多評含量測定方法，為新胃乃安片以及其他含有黃芪的藥品的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(配置Waters 2998二極管陣列檢測器、四元泵自動進樣系統、Empower化學工作站)；KQ-700DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水設備(法國，Millipore公司)；BS224S電子天平(德國Sartorius，萬分之一)；XR205SM-DR電子天平(瑞士Precisa，十萬分之一)。

1.2 試藥

毛蕊異黃酮苷對照品(上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號：111007，含量>98%)；芒柄花苷對照品(上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號：110930：含量>98%)；毛蕊異黃酮對照品(上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號：100618，含量>98%)；芒柄花素對照品(上海融禾醫藥科技發展有限公司，批號：100525，含量>98%)；乙腈(色譜純，Merk公司)；水為超純水；甲醇、甲酸等其余試劑均為分析純。

新胃乃安片(批號分別為20101002、20110301、20110302)以及黃芪陰性樣品，由廣州白云山中一藥業有限公司生產。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters XBridgeTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-0.1%甲酸為流動相，梯度洗脫：0～32 min，5%～18%乙腈；32～38 min，18%～22%乙腈；38～58min，22%乙腈；58～70 min，22%～34%乙腈；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；PDA檢測波長為260 nm。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品適量，分別加甲醇適量制成一定質量濃度的對照品母液，再分別吸取適量，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得質量濃度分別0.04、0.008、0.02、0.006 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取新胃乃安片10片，精密稱定，研細，精密稱取1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲(功率為280 W，頻率為40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補重，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液制備

取相當量的黃芪陰性樣品，按2.3項下的方法制備黃芪陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗

進樣上述3種溶液各20 μL，依法測定，結果表明，黃芪陰性對照溶液對試驗無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

注：A.混合對照品；B.新胃乃安片樣品；C.黃芪陰性對照；1.毛蕊異黃酮苷；2.芒柄花苷；3.毛蕊異黃酮；4.芒柄花素。圖1 對照品、新胃乃安片樣品及黃芪陰性對照HPLC圖

2.6 線性關系、定量限及檢測限考察

分別進樣上述混合對照品溶液2、5、10、15、20、30 μL各2針，依法測定。以質量濃度為橫坐標(X)，以峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸；再取2.2項下的各對照品儲備液分別加甲醇逐級稀釋，依法測定，計算定量限(信噪比為10∶1)和檢測限(信噪比為3∶1)。結果見表1，4種異黃酮成分在各自濃度范圍內呈良好的線性關系。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批號(20110301)質量差異項下的新胃乃安片6份，各1.0 g，按2.3項下的方法制備并測定，測得毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均含量依次為0.212、0.067、0.111、0.032 mg/片，RSD依次為0.2%、0.7%、0.3%、0.6%，結果表明該方法重復性良好。

2.8 精密度試驗

取2.7項下制備的同一份供試品溶液連續進樣6次，依法測定，計算6次進樣測得的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD依次為0.1%、0.2%、0.2%、0.2%，結果表明儀器精密度良好。

2.9 穩定性試驗

取2.7項下制備的同一份供試品溶液，分別于0、5、10、20、30、72 h進樣測定，計算測得的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積的RSD依次為0.1%、0.2%、0.2%、0.4%，結果表明供試品溶液在72 h內基本穩定。

2.10 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的新胃乃安片(批號：20110301)0.5 g，共6份，置具塞錐形瓶中，分別加入相當量的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的對照品，按上述方法平行制備測定，計算回收率。結果毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的平均回收率分別為103.5%、99.8%、99.4%、101.6%，RSD分別為1.5%、0.4%、0.6%、1.2%，結果表明該方法準確度良好。

2.11 一測多評法相對校正因子的計算

以毛蕊異黃酮苷為內參物，結合2.6項下混合對照品溶液系列進樣濃度及其所得的峰面積，參照王智民等提出的相對校正因子計算公式[8]，計算出毛蕊異黃酮苷與待測成分芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素間的平均相對校正因子分別為1.200、1.463、2.086，RSD值均≤3.7%。

2.12 耐用性考察

2.12.1 相對校正因子 分別考察了不同品牌的色譜柱、不同高效液相色譜系統、不同流速及不同柱溫對相對校正因子的影響，結果在不同條件下各相對校正因子的RSD在1.1%～2.6%，表明毛蕊異黃酮苷與待測成分芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素間的相對校正因子重現性良好，見表2。

2.12.2 待測組分色譜峰的定位 分別記錄上述考察的不同儀器不同色譜柱、不同流速及柱溫等條件下中各待測成分的保留時間，參照王智民等提出的相對保留時間計算公式[8]，計算出各待測成分與毛蕊異黃酮苷的相對保留時間，結果見表3，在不同條件下各成分間的相對保留時間值變化較小，RSD在2.2%～3.6%，芒柄花苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素與毛蕊異黃酮苷的相對保留時間分別為1.459、1.753、2.436。

2.12.3 樣品測定 取供試品3批，每批平行2份，按上述擬定方法測定，分別采用外標法和一測多評法計算4種異黃酮成分的含量，結果見表4，常規的外標法實測值與一測多評法計算的各成分含量的RSD均≤3.1%，說明2種方法測得結果沒有顯著性差異，一測多評法用于黃芪的成方制劑新胃乃安片的異黃酮類成分的質量控制是可行的。

表1 4種異黃酮成分的線性關系考察

表2 相對校正因子的影響因素和結果

表3 黃芪異黃酮成分相對保留時間的影響因素和結果

表4 黃芪異黃酮成分的一測多評結果 mg/片

3 討論

一測多評法是利用中藥有效成分之間內在的函數和比例關系，以樣品中某一典型組分(對照品廉價易得)為內參物，建立其與其他待測成分間的相對校正因子f，通過f計算出其他待測成分的含量，從而實現測定一個代表性成分同步監測多個指標成分[9-10]。待測組分色譜峰的定位、待測組分濃度、對照品純度以及色譜系統誤差等是影響一測多評法準確性的關鍵因素[11]，其中色譜系統誤差因素包括流動相的組成比例、pH值、柱溫、流速及檢測波長等的微小改變時和使用不同儀器、不同廠牌或不同批號的同類型色譜柱、不同實驗室、不同操作人員等[8]。研究中采用相對保留時間值對待測組分色譜峰進行定位，分別從3種不同品牌色譜柱和3種不同高效液相色譜儀、不同操作員、不同實驗室以及流速、柱溫等因素對相對校正因子和相對保留時間的重現性進行考察，結果RSD均<5%，表明該研究建立的一測多評法系統適用性較好。目前一測多評法在藥材及復方制劑中應用廣泛，但多以測定單味或多味藥材中同類多成分為主，而對復方制劑中多味藥材不同類成分的測定仍存在局限性[8，11]。

毛蕊異黃酮苷在黃芪中的含有量較高，藥理活性明確[12]，且又是《中國人民共和國藥典》中黃芪含量測定的指標成分，其對照品易得，在該實驗條件下分離度及峰形較好，因此以其為內參物。

采用PDA檢測器3D圖譜對檢測波長進行篩選，結果發現，在波長為249 nm與260 nm下樣品色譜圖的峰形和各成分的峰面積均較好，色譜峰數目基本一致。對上述兩種波長測得的毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的含量進行比較，結果4種成分含量差異不大，RSD均<5%，因研究中以毛蕊異黃酮苷為內參物，《中華人民共和國藥典》黃芪中毛蕊異黃酮苷含量測定的檢測波長為260 nm，因此選取260 nm作為檢測波長。

4 結論

該研究建立的一測多評法同時測定新胃乃安片中4種異黃酮成分的含量具有良好的重現性和穩定性，其測定結果與常規外標法所測的含量間無顯著差異，在對照品缺乏條件下，可作為新胃乃安片中4種異黃酮成分的質量評價方法。