RP-HPLC測(cè)定含銀杏葉提取物的注射液中維生素C的含量△

李玉彩，李響明*，周永妍，孫勝斌，姜國(guó)志

1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 051430

銀杏葉提取物具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的作用。含銀杏葉提取物的注射劑主要用于治療缺血性心腦血管疾病、冠心病、心絞痛、腦栓塞、腦血管痙攣等[1-2]。中藥注射劑中往往為了保護(hù)主藥，而加入維生素C、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉等抗氧劑。隨著抗氧劑在產(chǎn)品效期內(nèi)的不斷消耗，可能影響到注射劑的安全性、穩(wěn)定性。因此維生素C用量的確定及在產(chǎn)品有效期內(nèi)的變化需建立有效的監(jiān)測(cè)控制手段，而這方面的研究相對(duì)較少。

維生素C在水溶液中以互變異構(gòu)的形式存在，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被光、溫度、氧氣、金屬離子、pH等影響。由于中藥注射劑在生產(chǎn)過(guò)程中加入惰性氣體進(jìn)行保護(hù)，維生素C的降解相對(duì)較慢，但在實(shí)際測(cè)定過(guò)程中由于一般不添加惰性氣體或抗氧劑，導(dǎo)致維生素C降解較快，這也為維生素C的準(zhǔn)確測(cè)定增加了難度。《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版采用碘量法[3]測(cè)定維生素C的含量，文獻(xiàn)已報(bào)道過(guò)的測(cè)定維生素C含量的方法還有滴定分析法[4-6]、苯肼比色法[7]、熒光分析法[8-10]、分光光度法[11]、原子吸收法[12]、高效液相色譜法等[13-15]。因中藥注射劑本身顏色的影響，對(duì)滴定法終點(diǎn)的判斷有干擾；再者中藥注射劑中除已知成分和輔料外，還有其他成分，增加了準(zhǔn)確測(cè)定的難度。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260型高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，四元梯度泵；CPA225D電子天平(德國(guó)賽多利斯)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KH3200E型超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

乙腈(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸、冰醋酸、磷酸二氫鉀(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；純化水；其他試劑均為分析純。

含銀杏葉提取物的注射液為市售產(chǎn)品，如舒血寧注射液、銀杏葉提取物注射液。維生素C對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100425-201504)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件 十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以乙腈-0.03 mol·L-1磷酸二氫鉀水溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至4～5)(10∶90)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL·min-1；理論板數(shù)按維生素C峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取維生素C對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液溶解定容，制成每1 mL含維生素C 0.15 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 精密量取市售含銀杏葉提取物的注射液1 mL置10 mL棕色量瓶中，加0.9%醋酸溶液定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 韓佩蓮等[16]選擇維生素C最大吸收波長(zhǎng)為244 nm，也有研究[17-18]維生素C最大吸收波長(zhǎng)選擇分別為277 nm和280 nm。本研究中取維生素C對(duì)照品適量，制成每1 mL中含維生素C約0.15 mg的溶液，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)的掃描，結(jié)果在波長(zhǎng)280 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，確定其檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。

圖1 維生素C的紫外全波長(zhǎng)掃描圖

2.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性及專(zhuān)屬性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液、供試品溶液的高效液相色譜中維生素C理論塔板數(shù)分別是15 625、11 243，供試品溶液中維生素C峰分離較好，峰形對(duì)稱(chēng)，并且陰性無(wú)干擾，該方法專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖2～3。

圖2 對(duì)照品溶液的高效液相色譜圖

圖3 供試品溶液的高效液相色譜圖

2.2.3 線性范圍考察 取對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、10、20、30 μL測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。維生素C進(jìn)樣量在0.149 1～4.472 6 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3 055.5X+63.415，r=0.999 8。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積RSD為0.7%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液在室溫下避光放置，間隔15 min進(jìn)樣一次，分別于0、15、30、45、60、75 min測(cè)定，結(jié)果維生素C峰面積RSD為0.6%，表明75 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品分別平行制備6份供試品溶液，按照擬定的方法測(cè)定維生素C含量，測(cè)得維生素C含量的RSD為1.02%，表明重復(fù)性良好。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品9份，分別精密加入一定量的維生素C對(duì)照品，分別制成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定。維生素C的平均回收率為99.65%，RSD為1.12%。

表1 維生素C回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.3 含量測(cè)定

取注射液按照前述方法制備供試品溶液，并按擬定方法測(cè)定。供試品溶液維生素C峰形對(duì)稱(chēng)，部分批次結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

銀杏葉提取物注射液中未檢出維生素C，推測(cè)處方中未添加維生素C；該廠家說(shuō)明書(shū)成分中無(wú)維生素C，與本次測(cè)定結(jié)果一致。舒血寧注射液中B廠家未檢出維生素C，A、C廠家維生素C平均質(zhì)量濃度0.70 mg·mL-1，說(shuō)明本檢測(cè)方法可用于市售銀杏葉提取物注射液和舒血寧注射液中維生素C含量的測(cè)定。

3 結(jié)論

本研究采用普通液相色譜儀、恒定流速洗脫、固定檢測(cè)波長(zhǎng)，建立了測(cè)定含銀杏葉提取物的注射液中維生素C含量的RP-HPLC方法，結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單可靠，可作為含銀杏葉提取物的注射液中維生素C含量的質(zhì)量控制方法，樣品處理簡(jiǎn)便，色譜中各成分峰能達(dá)到良好的分離效果，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，快捷，易于掌握，重復(fù)性良好。