基于高通量測序研究草莓根際微生物群落結構和多樣性①

趙 帆, 趙密珍, 王 鈺, 關 玲, 龐夫花

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基于高通量測序研究草莓根際微生物群落結構和多樣性①

趙 帆1,2, 趙密珍1*, 王 鈺2, 關 玲1, 龐夫花1

(1 江蘇省農業科學院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，南京 210014；2 安徽大學資源與環境工程學院，合肥 230601)

研究草莓根際土壤微生物群落組成和結構，對健康草莓土壤生態系統的構建和保持具有重要意義。以不同地區草莓根際土壤為研究樣本，利用Miseq平臺Illumina第二代高通量測序技術并結合相關生物信息學分析土壤細菌16S rRNA基因V4+V5區域和真菌ITS1+ITS2區域的豐富度和多樣性指數以及群落結構。結果表明：從15個草莓根際土壤樣本中獲得4 554個細菌分類操作單元OTU和1 298個真菌OTU，草莓根際土壤的優勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，主要的優勢細菌屬有16種；優勢真菌門為子囊菌門、接合菌門和擔子菌門，主要的優勢真菌屬有8種。冗余分析(RDA)顯示，全氮和pH對土壤微生物群落結構的影響最大，共解釋了61% 的群落變化，各因子的貢獻率大小依次為土壤全氮>pH>有效磷>全鉀>全磷>有機質>速效鉀>堿解氮；相關性分析也表明，土壤理化指標均與不同優勢菌門存在密切的相關關系。本研究結果加深了對草莓根際微生物群落結構和多樣性的認識，為深入研究草莓根際微生物多樣性及功能與環境因子之間的關系提供了借鑒。

草莓；根際土壤；Illumina高通量測序；土壤微生物群落；土壤理化性質

草莓(Duch.)屬薔薇科(Rosa-ceae)草莓屬植物，是一種營養價值和經濟價值較高的水果，因其色、香、味俱佳，深受消費者青睞。草莓在同一地塊上連續種植兩年以上，地下病蟲害逐年加重，草莓長勢逐年變弱，表現為植株發育受阻，甚至死亡；果品質量逐年變劣，產量逐年下降。特別是近年來設施農業的快速發展，設施草莓栽培面積逐漸增加，草莓連作障礙發生越來越嚴重[1]，嚴重制約了草莓產業的發展，亟待解決。

土壤根際環境是一個特殊的生態系統，它與非根際土壤在生物學、化學等特性上具有顯著差異[2]。土壤根際環境受植物根系的影響，是有益微生物及有害微生物同宿主植物發生相互作用的一個區域，蘊含著充足的微生物資源[3]。土壤微生物能促進土壤有機質的分解及土壤養分的轉化，對維持土壤質量及推動土壤的健康發展具有十分重要的作用[4]。土壤微生物能夠影響土壤養分的吸收和轉化，微生物群落結構的失衡是連作障礙的主要原因[5]。

傳統的土壤微生物研究方法如微生物平板培養法、生物標記法、Biolog鑒定系統法等[6]會過低估計土壤微生物的群落結構組成，很難詳細描述出土壤微生物的群落結構組成方面的信息，也無法描述不同群體的生理差異。第二代測序Illumina MiSeq方法有效避免了通量低、操作復雜和準確率低等缺陷[6-7]，具有操作簡單和成本較低的優勢，并采用邊合成邊測序原理，結果可信度高。MiSeq高通量測序平臺，不僅實現了對多樣品的多個可變區同時測序，而且在測序速度和測序通量上都進一步得到提升。目前此平臺在微生物多樣性群落結構研究方面得到了廣泛的應用[8-9]。

一些研究發現隨著草莓連作程度的加深，根際土壤中細菌數量逐漸降低，真菌數量逐漸增加，細菌和真菌的比值逐漸降低，土壤微生物由“細菌型”向“真菌型”轉變，說明土壤真菌與草莓連作的關系密切，其中病原真菌是草莓連作障礙因子之一，主要包括鐮刀菌屬、輪枝菌屬、絲核菌屬、腐霉屬、疫霉屬、擬盤多毛孢屬和炭疽菌屬致病真菌。國內研究結果表明，草莓病原真菌以鐮刀菌和絲核菌為主[10]。草莓根際土壤微生物群落組成和結構目前還不清楚，本研究以不同地區草莓根際土壤為材料，采用高通量測序技術，探討不同地區草莓根際土壤微生物群落組成和結構，以期為草莓根際微生態環境研究提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2016年9—11月在江蘇省農業科學院草莓溫室大棚進行。

1.1 試驗材料

試材為生長整齊一致的三葉一心期“紫金久紅”草莓苗。盆栽土壤分別采集于江蘇省4個地區草莓連作大棚0 ~ 20 cm土層，分別是溧水白馬(BM)、邳州港上(G)、東海石榴(S)、溧水傅家邊(FJB)，再從溧水白馬一個多年沒有開墾的農田耕作層取土盆栽作為對照(CK)。

1.2 試驗設計

將不同土壤與珍珠巖以3∶1的體積充分混勻裝盆。塑料盆直徑16 cm，深20 cm，每盆裝土1 500 g，每盆栽草莓1株，每種土壤栽種20盆。草莓苗于2016年9月10日定植，定植后早晚各澆一次水且適當遮陰7 d，之后正常水、肥、光照管理，溫度維持在20 ~ 25 ℃，光周期約12 h (晝)/12 h (夜)。定植后50 d時(開花前)土壤取樣及測定分析。分析用土壤來自長勢較為一致的草莓根際土，采用抖土法獲取粘附在3株草莓根系表面上的根際土壤并充分混勻作為1個土樣，重復3次。所獲取的土壤一部分保存于?20 ℃冰箱用于土壤微生物分析，其余根際土壤風干后過 100 目網篩用于土壤理化性質的分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質測定 采用硫酸消解，微量凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用氫氧化鈉熔融，硫酸鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量；采用火焰光度計法測定土壤全鉀含量；采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量；采用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測定土壤有機質含量；采用碳酸氫鈉浸提，鉬銻抗比色法測定有效磷含量；采用乙酸銨浸提，火焰光度計法測定速效鉀含量；土壤pH用無CO2蒸餾水(水土質量比5∶1)浸提，pH計( METTLER TOLEDO)測定[11]。

1.3.2 土壤微生物基因組DNA的提取 提取試劑盒為Omega土壤微生物DNA提取試劑盒，土壤樣品0.5 g，按試劑盒的試驗步驟進行土壤微生物總DNA的提取，DNA樣品于?20 ℃保存待用。

1.3.3 PCR擴增及Illumina高通量測序 提取樣品總DNA后，根據設計得到細菌V4+V5 (F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，R：5′-CCGTCAATT-CMTTTRAGTTT-3′)和真菌ITS1+ITS2 (F：5′-CTT-GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R：5′-GCTGCGTT-CTTCATCGATGC-3′)合成的引物，合并引物接頭，進行PCR擴增。PCR反應體系：含15 mmol/L MgCl2的10×Buffer 10.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，10 μmol/L引物各5.0 μl，5 U/μl Taq酶1.0 μl，DNA模板4.0 μl，滅菌去離子水73.0 μl，總體積100 μl。PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 10 min。PCR擴增后，對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina HiSeq PE250進行測序，測序由南京集思慧遠生物科技有限公司完成。

1.4 生物信息分析方法

1.4.1 數據過濾及質量評估 數據過濾主要步驟：①去除平均質量值低于20的長Reads；②去除Reads含N的堿基數超過3個的長Reads；③Reads長度范圍為220 ~ 500 nt。

1.4.2 序列優化 利用Mothur軟件(version 1.34.4，http://www. mothur.org/)，進行序列優化，主要步驟[12]為：①對序列進行篩選，去除模糊堿基數大于0、單堿基高重復區大于8、重疊區錯配數大于0及長度大于97.5% 的序列(細菌)及重疊區長小于20 bp的序列(真菌)；②進行去冗余處理。

1.4.3 OTU聚類分析 為便于下游物種多樣性分析，將Tags聚類為OTU (operational taxonomic units)。首先，將拼接的Tags中的Singletons (對應Reads只有一條的序列)過濾掉，因為Singletons可能由于測序錯誤造成，故將這部分序列去除，不加入聚類分析。進而，利用Usearch在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU，每個OTU被認為可代表一個物種。

1.5 數據分析

隨機選取相似度在97% 條件下的OTU生成稀釋曲線，并利用軟件Mothur計算豐富度指數Chao和Observed species指數，多樣性指數Simpson和Shannon。基于RDP和UNITE分類學數據庫對OTU進行物種注釋，并用Excel和SPSS進行數據處理，利用Excel和R語言工具對樣品物種組成及相對豐度統計結果繪制柱狀圖和Veen圖。采用Canoco軟件進行冗余分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

由表1可知，不同樣品土壤理化性質表現出顯著差異。其中BM土壤全氮、全磷、有機質、速效鉀和有效磷含量顯著高于其他樣品，S土壤全鉀和堿解氮含量顯著高于其他樣品，FJB 土壤pH偏低，屬于酸性。

2.2 土壤樣品測序深度評估

15個細菌樣品測序，雙端reads拼接后共產生623 498條Raw Tags，序列優化后共得到566 667條Clean Tags，聚類后一共獲得4 554個OTU；15個真菌樣品測序，雙端reads拼接后共產生547 484條Raw Tags，序列優化后共得到542 038條Clean Tags，聚類后一共獲得1 298個OTU。參照文獻[13]隨機抽取測序序列，將抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建曲線，在97% 相似性水平下聚類OTU并制作各樣品的稀釋曲線(圖1)，可知細菌和真菌曲線逐漸趨向平坦，說明測序數量合理。

表1 草莓根際土壤理化性質

注：CK表示對照土壤，BM、S、FJB、G分別表示江蘇溧水白馬、東海石榴、溧水傅家邊、邳州港上草莓連作土壤；同列不同小寫字母表示不同土壤樣品間差異在<0.05水平顯著；下同。

圖1 土壤樣品細菌(A)、真菌(B)多樣品稀釋曲線

2.3 草莓根際土壤微生物群落豐富度和多樣性變化

Observed species指數和Chao指數可反映群落物種豐富度，由表2可知，BM以及S土壤細菌Observed species指數和Chao指數較高，相較于CK分別增加了10.80% 和14.50% 以及10.84% 和13.28%，但與CK無顯著性差異；FJB以及G土壤細菌Observed species指數相較于CK分別減少了24.04% 和21.61%，均有顯著性差異；Chao指數FJB與CK有顯著性差異，G與CK差異不顯著，BM、S和G分別與FJB有顯著性差異。BM以及S土壤真菌Observed species指數和Chao指數相較于CK分別增加了4.18% 和7.06% 以及7.41% 和8.35%，但與CK無顯著性差異；而FJB以及G土壤真菌Observed species指數和Chao指數較低，真菌Observed species指數相較于CK分別減少了40.74% 和40.88%，且有顯著性差異，真菌Chao指數相較于CK分別減少了37.32% 和38.51%，FJB與CK有顯著性差異，G與CK 無顯著性差異，BM和S分別與FJB和G有顯著性差異，FJB與G無顯著性差異。由此可見，土壤細菌和真菌群落物種豐富度的變化因區域的不同而存在較大差異。

Simpson指數和Shannon指數可反映群落物種多樣性。由表2可知，BM以及S土壤細菌Simpson指數和Shannon指數較高，相較于CK分別增加了3.12% 和5.34% 以及3.12% 和8.25%；FJB以及G土壤細菌Simpson指數和Shannon指數較低，FJB相較于CK其Simpson指數增加了1.04%，Shannon指數下降8.62%，G土壤相較于CK分別下降3.13% 和12.50%，但FJB、G與CK均無顯著性差異。BM土壤真菌Simpson指數最高，相較于CK增加了2.13%，S、FJB和G土壤真菌Simpson指數都低于CK，分別減少了4.26% 和3.19% 以及32.98%，S、FJB與CK 無顯著性差異，而G與CK 有顯著性差異；土壤真菌Shannon指數BM、S、FJB和G都低于CK，分別減少了1.72%、9.78%、17.67% 和42.53%，除G與CK有顯著性差異外，其他與CK 無顯著性差異，BM、S、FJB之間無顯著性差異，BM、S與G有顯著性差異。由此，可見土壤細菌群落物種多樣性的變化在不同區域間差異不顯著，而真菌群落物種多樣性存在差異。

表2 草莓根際土壤細菌和真菌群落豐富度和多樣性指數

2.4 草莓根際土壤微生物群落門類組成

從門的分類水平看，草莓根際土壤樣本中主要檢測出細菌10個門，分屬變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、疣微菌門、藍藻門、浮霉菌門。其中，變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為草莓根際土壤的優勢菌種(表3)，草莓根際土壤樣本中變形菌門的相對豐度為23.51% ~ 35.46%，厚壁菌門的相對豐度為11.51% ~ 29.17%，放線菌門的相對豐度為8.48% ~ 16.48%，酸桿菌門的相對豐度為6.4% ~ 15.14%，綠彎菌門的相對豐度為5.88% ~ 10.39%。在優勢菌種中，BM、S和FJB土壤放線菌門的相對豐度高于G和CK土壤，且FJB與CK差異顯著，BM、S、FJB和G土壤酸桿菌門的相對豐度都低于CK，且FJB與CK差異顯著。由此可見，草莓連作后土壤中細菌群落組成發生了變化。

測序結果表明，從草莓根際土壤中鑒定得到的真菌主要來自5個門，包括子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、壺菌門和球囊菌門 (表3)。其中，子囊菌門、接合菌門和擔子菌門為草莓根際土壤的優勢菌種(表3)，草莓根際土壤樣本中子囊菌門的相對豐度為52.39% ~ 87.67%，接合菌門的相對豐度為1.88% ~ 7.79%，擔子菌門的相對豐度為3.06% ~ 18.23%。子囊菌門相對豐度最高的為FJB(87.67%)，依次為G(85.02%)、S(66.79%)、CK(60.35%)、BM(52.39%)，擔子菌門的相對豐度BM、S、FJB和G都小于CK。說明草莓連作后土壤中真菌群落組成發生了變化。

在屬水平上，不同土壤樣品細菌優勢類群差異明顯。其中CK土壤優勢類群為乳球菌屬(1.74%)、芽孢桿菌屬(12.60%)和(1.11%)；BM土壤優勢類群為(3.44%)、中慢生根瘤菌屬(1.71%)、芽孢桿菌屬(6.58%)、乳桿菌屬(2.19%)、鏈霉菌屬(2.23%)、(2.81%)和豐佑菌屬(1.29%)；S土壤優勢類群為芽孢桿菌屬(7.04%)、鏈霉菌屬 (3.21%)、(1.36%)、(1.04%)、芽單胞菌屬(2.1%)和豐佑菌屬 (1.14%)；FJB土壤優勢類群為伯克氏菌屬 (7.68%)、(1.83%)、芽孢桿菌屬(11.78%)、乳球菌屬(2.44%)、鏈霉菌屬(5.60%)、(1.29%)和芽單胞菌屬(2.24%)；G土壤優勢類群為伯克氏菌屬(1.28%)、芽孢桿菌屬(19.65%)、乳球菌屬(3.29%)、(2.68%)和鏈霉菌屬(1.53%)。

對已確定分類地位至屬的真菌分析表明，不同土壤樣品真菌優勢類群差異也明顯(表3)。其中CK土壤優勢類群為被孢霉屬(5.25%)；BM土壤優勢類群為青霉菌屬(6.8%)、曲霉屬(4.45%)、(6.13%)、(3.62%)、被孢霉屬(7.26%)和(2.72%)；S土壤優勢類群為青霉菌屬(18.04%)、曲霉屬(2.36%)、鐮刀菌屬(1.85%)、被孢霉屬(7.41%)和鬼傘屬(1.5%)；FJB土壤優勢類群為青霉菌屬(28.52%)、曲霉屬(13.87%)、支頂孢屬(1.47%)、鐮刀菌屬(1.1%)和被孢霉屬(2.63%)；G土壤優勢類群為青霉菌屬(1.86%)、曲霉屬(2.16%)、(1.44%)和支頂孢屬(1.18%)。

表3 草莓根際土壤微生物在門和屬水平上的豐度變化(%)

續表

微生物分類水平 門屬CKBMSFJBG 細菌芽單胞菌門小計5.50 ± 0.90 b4.63 ± 0.47 b8.31 ± 0.55 a5.08 ± 0.60 b3.98 ± 1.33 b 芽單胞菌屬0.98 ± 0.15 b0.70 ± 0.07 bc2.10 ± 0.17 a2.24 ± 0.38 a0.60 ± 0.18 bc 擬桿菌門小計5.80 ± 1.26 a5.17 ± 0.12 a4.18 ± 0.56 ab2.76 ± 0.47 b3.59 ± 0.73 ab 黃桿菌屬0.26 ± 0.10 a0.23 ± 0.08 a0.71 ± 0.33 a0.56 ± 0.29 a0.52 ± 0.28 a Flavisolibacter0.51 ± 0.24 a0.15 ± 0.02 b0.13 ± 0.01 b0.28 ± 0.03 ab0.12 ± 0.05 b Niastella0.08 ± 0.03 abc0.16 ± 0.05 a0.05 ± 0.01 bc0.12 ± 0.02 ab0.07 ± 0.02 abc Ohtaekwangia0.14 ± 0.03 b0.21 ± 0.02 a0.03 ± 0.01 c0.00 ± 0.00 c0.04 ± 0.02 c Chitinophaga0.28 ± 0.18 a0.00 ± 0.00 b0.03 ± 0.00 b0.03 ± 0.01 b0.07 ± 0.04 ab 浮霉菌門小計4.64 ± 0.88 a4.55 ± 0.51 a3.86 ± 0.25 a3.96 ± 0.33 a3.09 ± 0.92 a 小梨形菌屬0.85 ± 0.28 a0.39 ± 0.03 ab0.44 ± 0.03 ab0.64 ± 0.09 ab0.38 ± 0.16 ab 浮霉狀菌屬0.62 ± 0.15 a0.74 ± 0.08 a0.61 ± 0.03 a0.17 ± 0.01 b0.48 ± 0.13 a 如出芽菌屬0.66 ± 0.16 a0.50 ± 0.04 a0.21 ± 0.03 b0.17 ± 0.04 b0.11 ± 0.05 b Pir4 lineage0.16 ± 0.05 bc0.33 ± 0.05 a0.16 ± 0.01 bc0.01 ±0 .01 d0.19 ± 0.06 b Singulisphaera0.13 ± 0.03 b0.08±0.02 b0.13 ± 0.01 b0.29 ± 0.04 a0.09 ± 0.04 b 藍藻門小計1.95 ± 1.14 ab1.42 ± 0.29 b1.07 ± 0.21 b3.14 ± 0.83 ab7.07 ± 3.68 a 鞘絲藻屬0.03±0.02 a0.00 ± 0.00 a0.04 ± 0.02a0.00 ± 0.00 a0.02 ± 0.00 a 微鞘藻屬0.01 ± 0.00 a0.04 ± 0.04 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.01 ± 0.00 a 念珠藻屬0.00 ± 0.00 b0.03 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b 席藻屬0.00 ± 0.00 a0.03 ± 0.02 a0.01 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a Chlorogloeopsis0.00 ± 0.00 b0.04 ± 0.02 a0.00 ± 0.00 b0.00±0.00 b0.00 ± 0.00 b Persicaria minor0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.01 ± 0.00 a0.01 ± 0.01 a 疣微菌門小計0.74 ± 0.06 b1.37 ± 0.07 a1.24 ± 0.19 ab0.80 ± 0.04 b0.71 ± 0.13 b 豐佑菌屬0.64 ± 0.02 b1.29 ± 0.07 a1.14 ± 0.21 ab0.74 ± 0.04 ab0.57 ± 0.10 b 交替球菌屬0.00 ± 0.00 c0.06 ± 0.01 ab0.02 ± 0.01 bc0.02 ± 0.00 bc0.07 ± 0.03 a 紫紅球菌屬0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 疣微菌屬0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 真菌子囊菌門小計60.35±7.15b52.39±0.73b66.79 ± 4.83b87.67 ± 1.11 a85.02 ± 5.33 a 青霉菌屬0.83 ± 0.38 b6.80 ± 0.45 b18.04 ± 1.84 ab28.52 ± 4.92 a1.86 ± 0.27 b 曲霉屬0.95 ± 0.25 c4.45 ± 0.65 bc2.36 ± 0.77 bc13.87 ± 2.83 a2.16 ± 0.87 bc Mycothermus0.00 ± 0.0 0 c6.13 ± 1.00 a0.11 ± 0.02 bc0.00 ± 0.00 c1.44 ± 0.44 b 支頂孢屬0.59 ± 0.31 a0.30 ± 0.03 a0.70 ± 0.24 a1.47 ± 0.27 a1.18 ± 0.53 a 鐮刀菌屬0.81 ± 0.37 ab0.21 ± 0.07b1.85 ± 0.86 a1.10 ± 0.22 ab0.13 ± 0.09 b Westerdykella0.06 ± 0.01 b3.62 ± 0.90 a0.04 ± 0.02 b0.04 ± 0.02 b0.03 ± 0.02 b 接合菌門小計5.25 ± 1.51 ab7.79 ± 1.38 a7.41 ± 2.15 a2.64 ± 0.39 b1.88 ± 0.66 b 被孢霉屬5.25 ± 1.51 abc7.26 ± 1.18 ab7.41 ± 2.15 a2.63 ± 0.38 cd0.58 ± 0.29 d 毛霉菌屬0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 擔子菌門小計18.23 ± 9.61a15.47 ± 5.73 a7.20 ± 2.34 a3.06 ± 0.77 a5.32 ± 1.72 a Phylloporus0.90 ± 0.29 a2.72 ± 2.48 a0.17 ± 0.09 a0.07 ± 0.05 a0.33 ± 0.17 a 隱球菌屬0.11 ± 0.10 b0. ± ±0.26 b0.22 ± 0.04 b0.23 ± 0.11 b0.67 ± 0.44 b Pseudozyma0.85 ± 0.69 a0.19 ± 0.06 a0.63 ± 0.20 a0.51 ± 0.03 a0.26 ± 0.11 a 鬼傘屬0.01 ± 0.01 a0.02 ± 0.01 a1.50 ± 1.49 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 馬拉色氏霉菌屬0.04 ± 0.02 b0.01 ± 0.00 b0.01 ± 0.00 b0.01 ± 0.00 b0.03 ± 0.03 b Bjerkandera0.08 ± 0.07 a0.05 ± 0.03 a0.07 ± 0.02 a0.30 ± 0.27 a0.02 ± 0.01 a 壺菌門小計2.10 ± 0.69 b6.16 ± 2.29 a0.30 ± 0.11 b0.04 ± 0.02 b1.07 ± 0.34 b Spizellomyces0.00 ± 0.00 b0.39 ± 0.16 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b Pateramyces0.01 ± 0.00 b0.24 ± 0.06 a0.07 ± 0.06 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b Rhizophlyctis0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.01 ± 0.01 a0.01 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 a 根生壺菌屬0.02 ± 0.02 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 球囊菌門小計0.08 ± 0.02 ab0.19 ± 0.10 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b Paraglomus0.00 ± 0.00 b0.19 ± 0.10 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b 球囊霉屬0.07 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b 其他小計13.99 ± 3.8018.00 ± 2.0518.30 ± 1.926.59 ± 0.466.71 ± 2.72

2.5 草莓根際土壤微生物類群分析

在97% 的相似度下，得到了每個樣品的OTU個數，CK、BM、S、G、FJB土壤分別獲得1 858、2 058、2 064、1 627和1 410個細菌OTU以及350、368、380、219和208個真菌OTU。Venn圖能夠反映組間或樣品之間共有和特有OTU數目，能夠直觀地表現出組間或樣品間OTU的重疊情況。從圖2中可以看出，不同地區之間共有806個細菌OTU以及107個真菌OTU，CK、BM、S、G、FJB土壤各自獨有202、274、147、386、190個細菌OTU以及206、172、141、76、71個真菌OTU。

圖2 草莓根際土壤細菌(A)、真菌(B) Venn圖

2.6 土壤理化性質對微生物群落的影響

為了解土壤理化因子對土壤微生物群落的影響，在門水平上對土壤微生物群落進行冗余分析(RDA)(圖3)。RDA分析的前兩個軸總共解釋了78.8% 的群落變化，第一個軸解釋了55.0%，第二個軸解釋了23.8%。土壤全氮對土壤微生物群落的影響最顯著，解釋了41% 的群落變化；其次是土壤pH，解釋了20% 的群落變化，所有理化因子總共解釋了90% 的群落變化，影響的順序為土壤全氮>pH>有效磷>全鉀>全磷>有機質>速效鉀>堿解氮。

為了解環境因子與土壤微生物群落的關系，對土壤中的優勢菌群(門水平)和土壤理化性質進行相關分析(表4)。結果表明：除變形菌門、放線菌門和酸桿菌門與所有理化指標相關性均不顯著外，其他優勢菌群都與土壤化學性質存在顯著相關性。厚壁菌門與全氮、全磷、速效鉀和有效磷含量呈顯著負相關(<0.05)，與有機質含量呈極顯著負相關(<0.01)；綠彎菌門與全氮含量呈顯著正相關(<0.05)，與全磷、堿解氮和有效磷含量呈極顯著正相關(<0.01)；子囊菌門與堿解氮含量呈顯著負相關(<0.05)，與全氮、全磷、速效鉀、有效磷含量及pH呈極顯著負相關(<0.01)；擔子菌門與全鉀含量呈顯著負相關(<0.05)，與全氮、速效鉀含量及pH呈極顯著正相關(<0.01)；除了全鉀含量，接合菌門與其他土壤理化因子均呈顯著正相關(<0.05)。

(圖中AN、AP、AK、TN、TP、TK、SOM分別表示土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮、全磷、全鉀、有機質)

3 討論

3.1 土壤微生物群落結構特征

表4 土壤優勢菌群(門水平)與土壤理化性質的相關性

注：*表示在<0.05水平上顯著相關，**表示在<0.01 水平上顯著相關。

土壤微生物群落是土壤生態功能的基礎，通過參與土壤有機質分解和礦化等過程影響著土壤養分的循環并調節和指示土壤功能[14]。土壤中存在大量的微生物，其中細菌的種類和數量最多[15]，細菌在有機物質的形成和分解、土壤營養元素的循環、肥力的保持和提高、植物的生長發育及病蟲害防治、生態環境的改善等方面均起著極其重要的作用[16]。測序結果表明變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為草莓根際土壤細菌的優勢菌種，其中變形菌門的相對豐度最高，為23.51% ~ 35.46%。目前已在擬南芥[17]、玉米[18]、枸杞[19]根際中發現變形細菌的富集分布，可見變形細菌能夠適應多種植物根際微環境。酸桿菌門作為優勢菌種的相對豐度為6.4% ~ 15.14%，與柳春林等[20]和Peralta等[21]研究結果一致。酸桿菌門能夠降解復雜的木質素[22]和纖維素[23]從而為土壤提供養分，殘留的草莓植株經過酸桿菌門的分解為土壤微生物提供了充足的能源[24]。通過對優勢菌種的分析，溧水白馬、邳州港上、東海石榴、溧水傅家邊4個區域的酸桿菌門的相對豐度都低于對照，這說明草莓連作會影響酸桿菌門細菌的生長發育，從而影響土壤養分。

土壤真菌是土壤微生物的重要成員，并與其他微生物一起推動著整個陸地生態系統的能量流動和物質循環，維持著生態系統的正常運轉[25]，是生態系統中極其重要的組成部分。測序結果表明，從草莓根際土壤中鑒定得到的真菌主要來自5個門，包括子囊菌門、接合菌門、擔子菌門、壺菌門和球囊菌門。其中，子囊菌門、接合菌門和擔子菌門為草莓根際土壤的優勢菌種。子囊菌和擔子菌是土壤中重要的分解者[26]，子囊菌門大多數為腐生菌，可以分解很多難降解的有機質，如木質素和角質素，在養分循環中擔任著重要角色[27]。測序結果還表明，鐮刀菌屬的相對豐度為0.13% ~ 1.85%，而鐮刀菌屬能夠侵染包括草莓的多種植物(糧食作物、經濟作物、油料作物、藥用植物及觀賞植物)，致使植物發生萎焉、穗腐、根腐等各種類型的腐爛病，導致嚴重的減產，造成重大的經濟損失[28]。

3.2 土壤微生物群落結構與環境因子的關系

土壤微生物群落結構和多樣性受多種因素的影響，外因包括氣候條件、植被類型、土壤類型和人類活動等，另一些是內因，主要是與土壤微生物生長密切相關的土壤有機質組成以及土壤養分等[29]。土壤微生物群落多樣性分析(表2)表明，土壤細菌群落物種多樣性的變化在不同區域間以及與對照間差異都不顯著，而真菌群落物種多樣性在區域間以及與對照間存在差異，這說明土壤真菌群落多樣性比細菌群落多樣性更受植物及其耕作方式等的影響。土壤微生物群落與土壤理化因子的冗余分析(圖3)表明，土壤全氮對微生物群落的影響最顯著，這與Liu等[30]的研究結果是一致的。氮肥影響了土壤微生物群落的結構組成，隨著氮肥濃度的增加，富養性的分類群落變形菌門豐度增加[31]。其次，pH對微生物群落的影響最顯著。土壤pH是影響微生物群落結構組成最重要的因素之一[32]。土壤其他理化因子對微生物群落結構都有重要的影響，說明土壤微生物群落結構與土壤環境關系密切。

植物種類對土壤微生物群落結構也有重要影響，相關研究表明植株根系分泌物對根際微生物群落結構組成具有選擇塑造作用，不同植物的根際微生物群落結構具有獨特性和代表性[33]。草莓的根系分泌物中含有乳酸、琥珀酸、己二酸、苯甲酸和對羥基苯甲酸，其中苯甲酸對根重具有明顯的抑制作用，對草莓生長抑制作用最強[34]?；形镔|可以單獨對草莓植株造成危害，也可與其他病原復合作用于草莓，同時能夠促進連作土壤中病原菌菌絲生長、孢子萌發及侵染，加重連作草莓根部病害，最終導致了草莓連作病害的發生[35]。近年來越來越多的學者認為，根系分泌物生態效應的間接作用以及土壤微生物區系紊亂是導致植物連作障礙發生的主要因素[36]。這可能是由于在根系分泌物特定組分的介導下，某些類群的微生物(如土傳病原菌)大量繁殖，同時抑制其他有益微生物(如假單胞菌等拮抗菌)的生長，進而改變了植物根系分泌物的組分和數量，為趨化性病原微生物提供更多的碳源和能源，形成惡性循環，最終造成植物生長發育不良[37]。

4 結論

1) 草莓根際土壤的優勢細菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，主要的優勢細菌屬有16種；優勢真菌門為子囊菌門、接合菌門和擔子菌門，主要的優勢真菌屬有8種。

2) 微生物群落結構受多種土壤環境因子的影響，本研究中土壤全氮和pH對微生物群落的影響最顯著。

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Microbial Community Structures and Diversities in Strawberry Rhizosphere Soils Based on High-throughput Sequencing

ZHAO Fan1,2, ZHAO Mizhen1*, WANG Yu2, GUAN Ling1, PANG Fuhua1

(1 Institute of Pomology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences & Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China; 2 College of Resources and Environment Engineering, Anhui University, Hefei 230601, China)

It is important for constructing and maintaining a healthy soil ecosystem to explore microbial community composition and structure in strawberry rhizosphere soil. Strawberry rhizosphere soils in different places were collected and used as study targets, the 16S rRNA genes of V4+V5 regions of soil bacteria and of ITS1+ITS2 regions of soil fungi were sequenced and analyzed by Illumina high-throughput sequencing technology on Miseq platform combined with related bioinformatics analysis to explore the changes of abundances, diversities and structures of soil bacteria and fungi. Results showed that a total of 4 554 bacterial operational taxonomic units (OTUs) and 1 298 fungal OTUs were obtained from 15 strawberry rhizosphere soil samples. At phylum level, dominant bacteria were Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Acidobacteria and Chloroflexi, dominant fungi were Ascomycota, Zygomycota and Basidiomycota. At genera level, there were 16 genera of dominant bacteria and 8 genera of dominant fungi. Redundancy analysis (RDA) showed that total nitrogen and pH had the greatest effect on soil microbial community structure, explaining 61% of the community changes. The order of contribution rate was total nitrogen > pH > available phosphorus > total potassium > total phosphorus > organic matter > available potassium > alkali-hydrolyzable nitrogen. Correlation analysis also showed that soil physiochemical characteristics were significantly correlated with different dominant microbial community. This study deepens the understanding on microbial community in strawberry rhizosphere and provides references for the relation between microbial composition and diversity with environmental factors.

Strawberry; Rhizosphere soil; Illumina high-throughput sequencing; Soil microbial community; Soil physiochemical characteristics

江蘇省現代農業研究開發示范類項目(BE2016369)和江蘇省農業三新工程項目(SXGC[2017]261)資助。

通訊作者(njzhaomz@163.com)

趙帆(1993—)，男，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事農業生態系統研究。E-mail: 843003818@qq.com

S663.9

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.01.008