土壤pH對活血丹生理特性及其藥材品質的影響①

鄒 俊，郭巧生，劉 麗，金 林，宋康麗，劉 蒙

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土壤pH對活血丹生理特性及其藥材品質的影響①

鄒 俊，郭巧生，劉 麗*，金 林，宋康麗，劉 蒙

(南京農業大學中藥材研究所，南京 210095)

為確定活血丹適宜種植區、完善活血丹種植技術、保障藥材品質，以野生活血丹扦插苗為試驗材料，用外源NaOH和H2SO4調節土壤pH，通過盆栽試驗，研究不同土壤pH(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)條件下，活血丹植株生長、生理特性及其藥材品質差異。結果表明：活血丹在pH 4.5 ~ 8.5能正常生長，在pH 9.5土壤中不能存活；在pH 4.5 ~ 8.5范圍內，活血丹生長指標包括葉長、葉寬、節間距、節間數、莖長以及干物質積累量均呈先增后降的趨勢，在pH 6.5達到峰值；活血丹葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性及葉綠素含量先增后降，可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸、丙二醛含量先降后增；活血丹藥材醇溶性浸出物含量均大于250 mg/g，符合藥典標準；活血丹藥材總黃酮、齊墩果酸和熊果酸含量變化趨勢與生長指標一致，峰值出現在pH 6.5時，分別為15.73、0.71和2.87 mg/g；綠原酸和咖啡酸含量在pH 6.5 ~ 8.5之間無顯著差異，整體高于其他pH處理；迷迭香酸含量在pH 7.5最高，為2.26 mg/g。土壤pH對活血丹生長、生理特性及其藥材品質影響顯著，中性或微酸性土壤利于活血丹的生長及其藥材品質形成。

土壤pH；活血丹；生長；生理；藥材品質

土壤pH是土壤各種化學性質的綜合反映，與土壤微生物的活動、土壤有機質的合成分解、營養元素的轉化與釋放及有效性、土壤養分保持能力等都有關系。土壤pH通過對土壤物理、化學及生物學特性的影響而使植物外觀形態、物質代謝、生長發育以及品質和產量等方面發生變化[1-2]。適宜的土壤pH條件下植物生長狀態良好[3]，生長調節能力強[4]，植物的凈光合速率達到最大值[5-6]，物質的吸收、同化合成、積累多[7-8]，可以為植物生長發育提供所需的養分和能源[9]。而土壤pH過高或過低則會引起細胞膜透性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性等生理指標的變化[10-11]。曾有學者研究表明：生長在中偏酸性土壤的三七其總皂苷含量高[12]，近堿性(平均pH為7.236)土壤條件可促進連翹藥材中連翹苷的積累[13]；滇重樓新老根莖總皂苷含量隨土壤pH升高而增加[14]，柔毛淫羊藿總黃酮和淫羊藿苷含量與土壤pH(5.99 ~ 8.22)呈極顯著正相關[15]；川芎有效成分與土壤pH(4.43 ~ 6.58)顯著負相關[16]。

活血丹(Nakai) Kupr.為唇形科活血丹屬植物，干燥地上部分入藥，藥材名連錢草，除西藏、新疆、青海、甘肅外，全國均有分布。味辛、微苦，性微寒，入肝、腎、膀胱經；具有清熱解毒、利尿排石、散瘀消腫的功效，用于治療尿路結石、肝膽結石等癥[17-18]，是膽樂膠囊、排石顆粒等中成藥的主要原料之一。近年來，隨著對肝膽系統結石癥研究的不斷深入，連錢草以其療效顯著、毒副作用小等特點越來越受關注[19]，需求量日益增加。為保障活血丹藥材實現安全、有效、穩定、可控，本試驗研究了不同土壤pH條件下，活血丹的生長和生理特性響應，以及其藥材活性成分的影響，以期為活血丹適宜種植區確定、完善活血丹種植技術、保障其藥材品質提供理論意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗土壤取自紫金山，晾干過0.5 mm篩。供試土壤基本理化性質如下：黏壤土，pH 7.0，有機質含量35.01g/kg，陽離子交換量242.08 mmol/kg，全氮1.779g/kg，全磷0.654g/kg，全鉀13.28 g/kg。供試植物采于南京紫金山，經南京農業大學中藥材研究所郭巧生教授鑒定為唇形科活血丹屬植物活血丹，2016年5月于南京農業大學中藥材研究所試驗大棚扦插育苗備用，8月中旬選擇長勢一致的健壯活血丹幼苗進行栽培試驗。盆高18 cm × 直徑12 cm，每盆裝1.5 kg過篩土壤，移栽5株大小一致的活血丹幼苗，試驗期間管理措施一致。

1.2 試驗設計

土壤原始pH為7.0，經過預實驗得知：土壤pH與NaOH的線性關系為= 0.6891+ 7.059(2= 0.991)，與H2SO4的線性關系為= –1.0362+ 6.917(2= 0.996)，其中表示土壤pH，1表示每千克土壤所需NaOH(g)，2表示每千克土壤所需H2SO4(ml)。緩苗后用NaOH或H2SO4調節土壤pH 至4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，每處理5盆重復，試驗中每3 d使用pH計測定pH，根據線性關系計算所需NaOH或H2SO4的量后，用蒸餾水配制成溶液均勻倒入盆中。

表1 試驗設計

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 活血丹生長指標的測定 10月中旬采收前進行測定，每盆隨機取3株，測定葉長、葉寬、節間距、節間數，莖粗、莖長及干重。葉長、葉寬為基部向上第3個莖節葉片的長度和寬度，節間距為基部向上第3個莖節和第4個莖節之間的長度，節間數為基部到頂部節間的數量，莖粗為基部向上第3個莖節和第4個莖節之間的莖節直徑，莖長為活血丹基部到頂部的長度，干重為每盆地上部分55 ℃烘干至恒重的重量。

1.3.2 活血丹生理指標測定 活血丹生理指標的測定材料均取其植株自上而下數第2莖節和第3莖節的幼嫩的完整葉片。葉綠素、類胡蘿卜素含量測定采用乙醇浸提法；游離氨基酸總量測定采用茚三酮顯色法，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250法；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑法，過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚法，過氧化氫酶(CAT) 活性測定采用高錳酸鉀滴定法，丙二醛(MDA) 含量測定采用硫代巴比妥酸法[20]。

1.3.3 活血丹藥材品質測定 活血丹地上部分采收后，洗凈、晾干，放入烘箱55 ℃烘干至恒重，用打粉機打粉，過60目篩備用。醇溶性浸出物按照藥典規定方法(通則2201)測定，總黃酮含量用分光光度法測定，三萜酸類(熊果酸與齊墩果酸)和酚酸類(綠原酸、咖啡酸、迷迭香酸)含量采用HPLC法測定。

三萜酸類測定條件分別精密稱取齊墩果酸、熊果酸對照品14.10 mg和11.20 mg，用甲醇溶解，然后定容至25 ml，4 ℃貯藏，配成濃度分別為0.564 mg/ml和0.420 mg/ml 的標準品溶液。精密稱取活血丹粉末(過60目篩)0.50 g，加入88% 乙醇39 ml，稱定重量，超聲提取(超聲頻率：40 kHz；超聲電功率：150 W) 60 min，取出靜置至室溫，稱定補足重量，過0.45 μm微孔濾膜。以乙腈(A)-0.05% 乙酸銨(B)為流動相進行等度洗脫，洗脫比例(A︰B)為77︰23，色譜柱為迪馬鉆石plus C18，4.6×250 mm，5 μm；檢測波長為210 nm；流速為0.5 ml/min；進樣量為10 μl。

酚酸類的測定條件為實驗室前期探索獲得，酚酸類供試品溶液制備：40% 乙醇，液料比40 ml/g，超聲時間100 min。酚酸類液相方法：乙腈(A)-0.01% 磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫，流速為0.8 ml/min，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μl，洗脫梯度為：0 ~ 15 min，A:10% ~ 15%；15 ~ 20 min，A:15% ~ 17%；20 ~ 23 min，A:17% ~ 25%；23 ~ 33 min，A:25% ~ 35%；33 ~ 36 min，A:35% ~ 95%；36 ~ 38 min，A:95%；38 ~ 43 min，A:95% ~ 10%；43 ~ 45 min，A:10%。色譜柱為迪馬鉆石plus C18，4.6 × 250 mm，5 μm。

1.4 統計分析

試驗數據采用 Excel 2003和SPSS 18. 0 軟件進行統計分析，不同處理間數據的差異性采用方差分析(LSD)，顯著性水平為 0.05。

2 結果與分析

2.1 土壤pH對活血丹生理特性的影響

2.1.1 土壤pH對活血丹光合色素的影響 活血丹在pH 4.5 ~ 8.5能正常生長，pH 9.5中不能存活，故下文未有pH 9.5相關數據。光合作用是生物界賴以生存的基礎，葉綠素作為進行光合的主要色素，其含量直接反映植物光合能力的強弱，同時也影響到植物生物量的積累。從表2可以看出，隨著土壤pH升高，活血丹葉片中葉綠素含量呈先增后降的趨勢：其中葉綠素a在pH 6.5達到最大值1.86 mg/g，分別為其他處理的1.73、1.44、1.41及1.54倍，與其他處理均達到顯著性差異；葉綠素b含量在pH 5.5 ~ 7.5之間時差異不顯著，但顯著高于pH 4.5與pH 8.5處理；葉綠素總量在pH 6.5達到最大值2.59 mg/g，分別為其他處理的1.52、1.29、1.28及1.38倍，與其他處理均達到顯著性差異；葉綠素a/b也在pH 6.5達到最大值，分別為其他處理的1.45、1.42、1.37及1.39倍；土壤pH對類胡蘿卜素含量影響較小，各處理間差異不顯著。

表2 土壤pH對活血丹光合色素的影響

注：表中同列數據小寫字母不同表示處理間差異達<0.05 顯著水平，下表同。

2.1.2 土壤pH對活血丹游離氨基酸、可溶性蛋白及可溶性糖含量的影響 可溶性糖、可溶性蛋白與游離氨基酸都是光合作用的產物，它們既是植物主要的營養物質也是滲透調節物質。如圖1所示：土壤pH對活血丹葉片游離氨基酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量有均有顯著影響。三者隨著土壤pH的增加呈先降后升的趨勢，在pH 6.5達到最小值，分別為25.17 μg/g、15.59 mg/g、14.3 mg/g；土壤pH 6.5條件下，活血丹植株可溶性糖含量為其他pH處理的75.44%、85.49%、72.51% 和71.91%，可溶性蛋白分別為其他處理的67.55%、84.62%、90.28% 和86.10%。

2.1.3 土壤pH對活血丹葉片保護酶及丙二醛的影響超 氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)是主要的抗氧化酶，能清除植物體內多余的自由基，防止自由基的毒害；丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產物之一，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統受損程度以及植物的抗逆性。不同土壤pH對活血丹葉片SOD、POD、CAT活性及MDA含量的影響結果見圖2：SOD、POD及CAT活性隨著土壤pH的增加呈先增后降的趨勢，最大值出現在土壤pH 6.5時，分別為310.32 U/g、3 615.56 U/(g·min) 和25.84 mg/(g·min)，SOD和CAT活性在不同處理間有顯著差異，但POD活性在不同處理間的差異未達顯著水平。

MDA含量隨著土壤pH的增加呈先減少后增加的趨勢，在pH 6.5時為最小值10.88 nmol/g，分別較其他處理少18.24%、13.83%、4.44% 和8.65%。pH 6.5處理的保護酶活性和MDA含量與pH 7.5處理均未達到顯著性差異。

2.2 土壤pH對活血丹生長的影響

不同的土壤pH對活血丹生長指標具有顯著的影響，其結果如表3所示。

可耐受土壤pH范圍內，活血丹植株生長和干物質積累量均隨土壤pH的增加而呈現先升后降的趨勢，在土壤pH 6.5時與其他處理有顯著差異，植株生長最為健壯：如葉片長、寬較其他處理顯著增大，葉片長寬比顯示此時葉片更扁一些；莖長最大值60.53 cm分別為其他處理的2.22、1.71、1.39和1.51倍；莖直徑最大值1.38 mm分別為其他處理的1.42、1.26、1.24和1.44倍，尤其活血丹干物質積累量甚至可以達到其他處理的7.16、2.26、1.21、1.96倍。但折干率在不同處理間未達到顯著性差異，這可能與植物在適宜土壤pH條件下的水分吸收特性相關。

2.3 土壤pH對活血丹藥材品質的影響

土壤pH對活血丹藥材醇溶性浸出物及活性成分的含量影響結果如圖3所示，不同土壤pH下，活血丹醇溶性浸出物含量均高于250 mg/g，符合藥典規定標準。活血丹內總黃酮含量在土壤pH 4.5 ~ 8.5之間呈單峰曲線，峰值在土壤pH 6.5處，為15.73 mg/g，與除pH 5.5處理外的總黃酮含量差異顯著。就三萜酸含量而言，齊墩果酸和熊果酸含量的最高值0.71 mg/g和2.87 mg/g也出現在土壤pH 6.5時，與其他處理達顯著性差異。植株內3種酚酸隨土壤pH的變化則不盡相同，植株綠原酸和咖啡酸含量隨土壤pH的增加為先增加后穩定的趨勢，在pH 6.5 ~ 8.5之間顯著高于pH 4.5和pH 5.5處理；迷迭香酸含量的變化比較復雜，呈現降-升-降的趨勢，pH 7.5時最高，為2.26 mg/g，與其他處理均達到顯著性差異。

(圖中小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)，下圖同)

圖2 土壤pH對活血丹葉片保護酶活性及丙二醛含量的影響

表3 土壤pH對活血丹生長的影響

圖3 土壤pH對活血丹化學成分含量的影響

3 討論

3.1 活血丹生理特性與土壤pH的相關性

本研究發現活血丹光合色素在土壤pH 4.5 ~ 8.5之間，隨著土壤pH增加呈先增后減的趨勢，在pH 6.5達到最大值。喻崎雯等[21]曾對不同土壤pH對普通野生稻生理特性的影響研究發現葉綠素含量隨著pH的增加先增后減；孫曉剛等[7]也提出酸堿脅迫下牡丹3個品種的chla、chlb、chla+b的含量有所下降，降幅隨脅迫程度的加深而增大，不利土壤pH會提高色素酶的活性，加速光合色素降解。

試驗中活血丹葉片氨基酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量隨著土壤pH的增加呈先降后升的趨勢，谷值在土壤pH 6.5出現，可能是由于土壤pH 4.5、5.5、7.5、8.5對于活血丹生長造成一定脅迫作用，影響了光合產物的積累，該情況在土壤pH 4.5時更為顯著。而康洪梅等[22]研究表明毛枝五針松可溶性糖及脯氨酸含量隨著pH的增加先增加后減少；喻崎雯等[21]研究表明在pH為6.8的中性條件下，普通野生稻葉片可溶性糖含量最高。這可能是因為土壤pH是活血丹生長的關鍵因素，不良土壤pH條件下，活血丹植株合成更多的氨基酸、可溶性糖和可溶性蛋白等滲透調節物質來增強其抵抗能力，具體機理有待進一步深入研究。

本研究顯示隨土壤pH的增加，超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)均呈先增加后減少的趨勢，且均在pH 6.5達到最大值，pH 5.5 ~ 7.5處理間差異均不顯著，表明在pH 5.5 ~ 7.5時活血丹葉片抗氧化和抗衰老能力較強。馮建燦等[11]也提出過喜樹中保護酶活性隨著pH的增加先增后減。試驗中活血丹丙二醛(MDA) 含量在 pH 6.5和pH 7.5時較低，其他 pH處理下 MDA 含量顯著升高，而崔喜艷等[10]研究表明煙草MDA含量與pH增長呈正相關，這可能是由于所研究物種和植物不同生長期的差異而造成的。

3.2 活血丹生長與土壤pH的相關性

土壤 pH 對土壤肥力及養分的有效性影響很大[23]，土壤過酸或過堿，都會降低植物所需養分的有效性，導致植株某些元素營養失調[24]。活血丹植株在土壤pH 6.5 ~ 7.5形態最為飽滿健壯，干物質積累量最大，即適宜土壤pH的養分有效性高、利于活血丹的生長及生物量的積累，而不利酸堿條件時土壤養分有效性降低、肥力下降，任廣煉和李凌[3]、卿尚模等[4]、孫曉剛等[7]、伍杰等[8]學者也曾有類似報道。但折干率變化趨勢隨土壤pH的增加先減后增，且沒有達到顯著差異，可能是在不利酸堿條件下，活血丹細胞失水導致含水量降低所致。

3.3 活血丹藥材品質形成與土壤pH的相關性

綠原酸、咖啡酸與迷迭香酸三者具有較強的抗氧化、抑菌、抗炎藥理作用[25-27]，曾有學者從活血丹中檢測并分離到[28]，此外也有報道將總黃酮、熊果酸和齊墩果酸作為活血丹質量評價的指標性成分[29-30]，同時結合藥典標準，本試驗選擇醇溶性浸出物、總黃酮、三萜酸類(齊墩果酸及熊果酸)、酚酸類(綠原酸、咖啡酸與迷迭香酸)共同作為活血丹藥材品質評價參考指標。試驗中活血丹藥材醇溶性浸出物、總黃酮、齊墩果酸及熊果酸含量最大值均在土壤pH 6.5 ~ 7.5時，隨著土壤酸堿度的增強其含量減少。尚辛亥等[31]曾報道在適宜的土壤中生長的高山紅景天活性成分和產量最高。許興等[32]也提出土壤含鹽量過高與過低都不利于枸杞果實多糖含量的積累。活血丹藥材綠原酸、咖啡酸及迷迭香酸含量三者變化大趨勢類同，綠原酸和咖啡酸在pH 6.5 ~ 8.5含量較高但彼此間無顯著差異，迷迭香酸在pH 7.5含量最高，即表明酚酸類物質在中性和堿性土壤中積累較多。可能是堿性土壤中，養分有效性降低，促進了活血丹產生酚酸類物質以抵御不良生長環境。

4 結論

活血丹在pH 4.5 ~ 8.5均能生長且醇溶性浸出物均能達到藥典規定標準，在pH 9.5土壤中不能存活；不同土壤pH對活血丹生長指標、生理指標及其藥材品質形成影響顯著，中性微酸性土壤利于活血丹莖葉生長、光合色素形成、干物質積累及其指標性成分的形成。

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Effects of Soil pH on Physiological Characteristics and Medicinal Qualities of.

ZOU Jun, GUO Qiaosheng, LIU Li*, JIN Lin, SONG Kangli, LIU Meng

(Institute of Chinese Medicinal Materials, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to determine the suitable cultivation area, improve the cultivation technology and guarantee the medicinal quality of, the effects of soil pH (4.5, 5.5, 6.5, 7.5, 8.5 and 9.5) on growth, physiological characteristics and medicinal quality ofwere studied with exogenous NaOH and H2SO4as pH regulators. The results showed thatcould grow normally in soil with pH from 4.5 to 8.5, but could not survive in soil with pH 9.5. The growth indicators ofincluding leaf length, leaf width, pitch interval, internode number, stem length and dry matter accumulation increased initially and then decreased when soil pH varied from 4.5 to 8.5, peaking at pH 6.5. The activities of SOD, POD, CAT and the content of chlorophyll inleaves were first increased and then decreased, while the contents of soluble sugar, soluble protein, free amino acid and malondialdehyde inleaves were reduced initially, and then increased. The contents of ethanol-soluble extractives were greater than 250 mg/g, conforming to the quality criterion in Chinese Pharmacopoeia 2015. The variation trend of total flavonoids, oleanolic acid and ursolic acid contents ofwere similar to those of growth indexes; the highest contents of total flavone, oleanolic acid and ursolic acid were appeared in pH 6.5, with the contents of 15.73, 0.71 and 2.87 mg/g, respectively. The contents of chlorogenic acid or caffeic acid in pH 6.5, 7.5 and 8.5 treatments showed no significant difference, but generally higher than other treatments. The highest content of rosmarinic acid (2.26 mg/g) was observed in pH 7.5 treatment. It is concluded that soil pH has significant influence on growth, physiological characteristics and medicinal quality of, and neutral or slightly acidic soil is conducive to the growth and the medicinal qualityof

Soil pH;; Grow; Physiological metabolism; Medicinal quality

國家自然科學基金項目(41471243)資助。

通訊作者(liuli@njau.edu.cn)

鄒俊(1992—)，男，河南信陽人，碩士研究生，主要從事中藥材規范化生產研究。E-mail：2015104129@njau.edu.cn

S282.2

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.01.010