一株寄生曲霉Q527對黃野螟的感染作用及生物學特性

趙鵬飛，常明山，羅 輯 ，吳耀軍 ，楊 娟 ，楊振德

（1.廣西大學林學院，廣西 南寧 530004；2.廣西優良用材林資源培育重點實驗室/廣西林業科學研究院，廣西 南寧 530002；3.崇左市森林病蟲害防治檢疫站，廣西 崇左 532200）

【研究意義】黃野螟（Heortiavites soides Moore）隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科，是土沉香〔Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg〕生長過程中危害最嚴重的食葉性害蟲。一齡幼蟲和二齡幼蟲群居生活，把葉子吃到只剩下薄薄的葉脈，三齡幼蟲可啃食整個葉片結構，分散危害，危害面積擴大。黃野螟幼蟲從低齡發育到高齡時間較短，一般在發現其危害及準備防治時，其接近或進入高齡期，暴發時將受害區內的土沉香全部吃光，造成樹勢下降甚至死亡，嚴重影響土沉香正常生長［1-2］。在土沉香生產中的防治途徑主要依靠物理防治和化學防治，物理防治主要是利用殺蟲燈和蜜源植物對黃野螟成蟲進行誘殺和對各代卵期、幼蟲期，或組織人力摘除有蟲枝葉［3］；化學防治中不同類型殺蟲劑的作用方式存在差異，對黃野螟的防效也存在顯著差異［4］。然而物理防治人工成本過高，防治成本一般; 化學防治污染環境，害蟲容易產生抗藥性。由于繁殖迅速、世代重疊、易于爆發成災［5-7］，因此增加了害蟲治理成本和難度，治理過程中也會對寄主和周邊環境造成影響。可持續資源發展的重要研究領域之一就是生物防治，微生物農藥的研究與利用正是現代生物防治的一大特點［8］，因此探索新型生物防治措施具有重要現實意義。

【前人研究進展】有關蟲生真菌對鱗翅目的影響研究已有一些報道，安建梅等［9］研究表明粉質擬青霉對黃刺蛾幼蟲有很高的毒力且具有良好的防治效果，致病死亡率為84%。何勁等［10］研究證實4株蟲生真菌對小菜蛾防治中的應用和毒力，結果表明其具有良好的毒殺作用。劉愛英等［11］研究了玫煙色擬青霉和斜鏈擬青霉對煙草粉螟感染力和致病作用，發現二者具有很好的防控潛力。【本研究切入點】從自然死亡黃野螟尸體上分離發現1株對黃野螟具有高侵染力的菌株，黃野螟被侵染2d后蟲體開始出現菌絲體。對該黃野螟寄生菌進行分離鑒定，確定為寄生曲霉Q527（Aspergillus nomiusQ527），曲霉對黃野螟的致死作用和生物學特性至今國內外尚未見報道。【擬解決的關鍵問題】由于蟲生真菌的防治效果容易受到環境因子的影響，只有掌握最有利于蟲生真菌的生長條件及產孢特性，才能為有效利用其防治黃野螟危害。為探討寄生曲霉Q527控制黃野螟危害的可能性，本研究測定其對黃野螟的感染作用，并對寄生曲霉Q527生物學特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年8月于廣西壯族自治區憑祥市東盟林業產業園種植區的土沉香林采集黃野螟幼蟲。將采集幼蟲放入網袋內，采集500頭以上，帶回室內于人工氣候箱內飼養，喂以新鮮土沉香葉片，飼養溫度為26（±1）℃，相對濕度為85%，光周期為16∶8 （L∶D）。

寄生曲霉Q527菌株從自然罹病死亡的黃野螟幼蟲體表分離得到，通過形態學和分子生物學方法鑒定為寄生曲霉Q527（Aspergillus nomiusQ527），保存于廣西林業科學研究院森林保護實驗室。

供試培養基：PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；SDAY培養基：蛋白胨10 g、酵母浸出物10 g、葡萄糖40 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；PCA培養基：胰蛋白胨5.0 g、酵母浸粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15.0 g和蒸餾水1 L；PSA培養基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；OA培養基：燕麥片30 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；WA培養基：瓊脂20 g和蒸餾水1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 毒力測定 菌株在26℃條件下培養15 d，用含0.5%吐溫-80的無菌水配制孢子懸浮液，血球板計數濃度為1.0×108個/mL。幼蟲采用浸漬法接種［12］，將同一批次老熟幼蟲浸入20 mL孢子懸浮液2 min后，把幼蟲挑入放置土沉香葉片的飼養盒中，每盒20頭幼蟲。每個處理3次重復，設含0.5%吐溫無菌水為對照。每天定時觀察記錄發病特征及死亡情況，持續觀察7 d。

1.2.2 培養基對菌株生長的影響實驗 將供試菌株在PDA培養基上活化培養7 d。用直徑為5 mm的打孔器在上述PDA培養基中打出菌塊，然后分別接入事先倒好的供試培養基。觀察并記錄生長趨勢和形態顏色。

1.2.3 pH對菌株生長的影響實驗 分別將菌塊接入 pH為 5、6、7、8、9、10、11、12的 PDA培養基中，放置26℃恒溫培養箱中，每個處理3次重復。培養5 d，采用十字交叉法測量其菌落直徑培養［13］；培養20d，鏡檢并計算各處理平均產孢量。

1.2.4 高溫對菌株生長的影響實驗 分別將菌塊和孢子懸浮液放入無菌離心管內，放置溫度為35、40、45、50、55、60、65 ℃的水浴鍋內加熱10 min后，接入PDA培養基，放置26 ℃恒溫培養箱中，每個處理3次重復，直徑計算同1.2.3，分生孢子萌發率計算方法參照杜奕君等［14］并略有改進。

1.2.5 不同碳和氮源對菌株生長的影響實驗 采用真菌生理培養基［15］分別以葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和麥芽糖為碳源測定菌株對不同碳源的利用；分別以蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨和硝酸鈣為氮源測定菌株對不同氮源的利用，以不加入碳源和氮源的培養基為對照。將菌塊接入準備好的培養基中，放置26 ℃恒溫培養箱，每個處理3次重復，直徑和產孢量計算同1.2.3。

1.2.6 光照對菌株生長的影響實驗 分別將接入菌塊的培養皿置于光照、光暗12 h交替和全黑暗的26℃恒溫培養箱中，每個處理3次重復。直徑和產孢量計算同1.2.3。

數據處理和計算均采用Excel和SPSS 22.0。

2 結果與分析

2.1 寄生曲霉Q527菌株的殺蟲活性

用曲霉Q527孢子懸浮液對健康的黃野螟幼蟲進行接種，在保濕的無菌環境下培養數天后，從頭部和腹部的關節處長出了菌物（圖1，封三）。菌物從最初的白色變為明黃色，經分離純培養，在PDA培養基上逐漸形成淺黃色至淡綠色的菌落。用純培養菌種接種健康的黃野螟，再次出現大量試蟲死亡，死蟲經保濕無菌培養數天后又長出形態相似的菌物。將這些菌物再分離純化培養在PDA培養基上后，得到的菌株形態特征及菌落與孢子特征均與原接種菌株一致。上述結果表明，由科赫氏法則確定寄生曲霉Q527為黃野螟的致死病原菌。

圖1 黃野螟幼蟲感染過程Fig. 1 Infection process map of Heortiavites soides larvae

不同空間尺度下西南高原山地基本農田質量景觀格局分析（內文第120～129頁）圖版

黃野螟幼蟲經菌株Q527接種處理，接種后1 d行動遲緩，食量降低，蟲體開始發暗，蟲體飽滿保持原有形狀，接種后2 d逐漸開始死亡，蟲體出現變褐、變黑及僵硬的癥狀，可見白色的菌絲從病發區長出，接種后3 d蟲體產生大量菌絲并被其覆蓋。接種后4 d蟲體逐漸干癟體積縮小，菌株的顏色轉為黃綠色。在室內條件下對黃野螟接種處理后，致死效果明顯，菌株的致死率均與對照存在顯著差異，接種后2 d內死亡率較低，接種后3 d死亡率升高，為74.1%；隨后死亡率逐漸平緩， 接種后7 d幼蟲死亡率為83.3%（圖2）。

圖2 黃野螟幼蟲日死亡率Fig. 2 Daily mortality of larval of Heortiavites soides

2.2 培養基對寄生曲霉生長的影響

供試的 6種培養基中菌株Q527在PDA培養基上生長最好，菌絲十分厚實，顏色表現前期為白色，后期為黃綠色。菌落直徑達78.18 mm，與其他培養基存在極顯著差異；其次是在SDAY和PSA培養基上生長速度較好，菌絲濃密程度一般，菌落直徑分別為42.85 mm和41.58 mm；在SDAY培養基上菌絲較為稀疏，在PSA培養基上可以看到明顯輪紋；在PCA培養基上生長速度相對一般，但菌絲較為濃密，菌落直徑為39.33 mm；在燕麥培養基上生長速度相對較差且輪紋不明顯，菌落直徑為36.82 mm；在WA培養基不生長。

2.3 pH值對寄生曲霉生長的影響

從圖3可以看出，寄生曲霉Q527生長pH范圍比較廣，在pH5.0～12.0范圍內均可生長，有極強的耐堿性，不同pH對該菌的生長影響差異顯著。其在pH為8.0生長最快，菌落直徑為78.12 mm。培養20 d后觀察其產孢量發現，該菌株在pH5.0～12.0之間都可以產孢，在過度的偏酸性條件下，產孢量會受到明顯抑制。pH5.0時產孢量最低，每皿分生孢子為4.07×108個；在pH8.0時產孢量最高，每皿分生孢子為2.61×109個；隨著pH的繼續升高，產孢量也會逐漸變少。表明寄生曲霉Q527適宜生長偏堿性環境中，pH8.0最為適宜。

圖3 不同pH值對寄生曲霉的生長和產孢量的影響Fig. 3 Effects of different pH on mycelial growth and sporulation

2.4 高溫對寄生曲霉生長的影響

高溫對寄生曲霉Q527生長的影響測定結果（圖4）表明，其在35～60℃溫度下菌株可恢復生長，孢子均可萌發。但菌絲生長受溫度變化的影響差異極顯著，在35℃菌絲長勢最好、邊緣整齊，菌落直徑為81.18 mm，菌絲在65℃水浴10 min后再次接入培養基中停止生長，表明隨溫度升高，菌絲生長速度減緩直至死亡。曲霉Q527孢子萌發受溫度變化明顯，菌株的孢子萌發率均隨溫度的升高而減小。分生孢子在65℃時停止萌發，在35 ℃時孢子萌發率最高，為98.13%。

圖4 高溫對菌絲的生長和孢子萌發的影響Fig. 4 Effects of high temperature on mycelial growth and spore germination

2.5 碳源對寄生曲霉生長的影響

從圖5可以看出，菌株Q527在測試的5種碳源培養基上均可生長，但對各碳源利用程度不同。從菌落生長速度看，發現其對乳糖具有很好的利用率，在含乳糖的培養基上，菌絲生長速率最快，菌落直徑為37.97 mm。碳源對菌絲生長速度和產孢量的影響沒有明顯相關性，不同碳源對病原菌產孢影響也不同，最適合產孢的為含可溶性淀粉的培養基，培養20 d平均產孢量為2.03×109個/皿；含葡萄糖、乳糖和麥芽糖的碳源培養基均可以產孢。不同碳源對菌株Q527影響差別較大，在不含碳源的培養基上生長速度和產孢量最低，說明碳源可以促進菌株Q527生長和產孢。

圖5 不同碳源對寄生曲霉的生長和產孢量的影響Fig. 5 Effects of different carbon sources on mycelial growth and sporulation

2.6 氮源對寄生曲霉生長的影響

從圖6可以看出，不同氮源培養基對菌株Q527菌絲生長影響差別較大，蛋白胨是菌絲生長最快及產孢量最多的氮源，培養7 d菌落直徑達到51.09 mm；培養20 d產孢量達2.96×109個/皿；在含氮培養基中，硝酸鈣培養基的產孢量最低，培養20 d產孢量為0.74×109個/皿，表明硝酸鈣作為氮源不適合菌株Q527產孢；硝酸鉀和硫酸銨作為氮源和空白對照比較，發現其抑制菌絲生長。在不含氮源的培養基上產孢量最低，說明含有氮源可以促進菌株Q527產孢。

圖6 不同氮源對寄生曲霉生長和產孢量的影響Fig. 6 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth and sporulation

2.7 光照條件對寄生曲霉生長的影響

光照對寄生曲霉Q527生長的影響結果（圖7）表明，菌絲生長受光照條件的影響差異顯著。全黑暗條件下，菌絲生長速度最快，菌落直徑為78.18 mm；光暗12 h交替下生長速率居中，菌落直徑為76.04 mm；連續光照條件下生長速率最低，菌落直徑為40.21 mm。產孢量受光照條件的影響差異顯著，黑暗條件可促進寄生曲霉Q527產孢，產孢量為2.63×109個/皿。在不同光照條件下，持續光照對菌株產孢有抑制作用，但是產孢時間較早。

圖7 不同光照條件對寄生曲霉生長和產孢量的影響Fig. 7 Effects of different light conditions on mycelial growth and sporulation

3 討論

蟲生真菌資源極為豐富，而我國已發現的昆蟲病原真菌涉及40多個屬400種［16］。白僵菌［17］、綠僵菌［18］和曲霉菌是自然界重要的蟲生真菌資源，在生物防治中很早就被發現和利用。前人通過大量研究認為曲霉屬的多種曲霉可作為生防菌可以用來防治目的昆蟲，如采用煙曲霉和葡萄曲霉的融合菌株對松墨天牛越冬幼蟲有較高的致死率［19］、米曲霉可抑制小菜蛾取食量減少并導致定殖率下降［20］、黃曲霉和溜曲霉對瓜實蠅成蟲有較高毒性及防治效果［21］等。本研究首次報道寄生曲霉Q527對黃野螟幼蟲具有良好的感染作用并在短期內導致黃野螟幼蟲大量死亡。在病發蟲體上發現黃霉層，可能是寄生曲霉直接侵染和次生代謝產物致病相互作用的結果［22］。曲霉生長發育除了對環境有更高要求外，營養元素的細微變化也會直接且迅速影響菌絲生長［23］。曲霉屬不同種和不同菌株的最適外界環境和營養條件有所不同［24］，本試驗結果也說明了培養基、pH、碳源、氮源和光照的差異對曲霉Q527的生長和產孢量存在較顯著影響。寄生曲霉在防治農林害蟲具有十分明顯的優勢，但是生物防治的前提是針對不同菌株的特定培養條件進行培養，這需要對不同菌株的外界培養環境和內在營養條件進行研究，以期達到最大產孢量，這也是真菌大規模生產的要求［25］。隨著新型技術的日漸成熟，有助于此菌種大規模在林間推廣［26］。

4 結論

本研究結果表明，黃野螟幼蟲的寄生曲霉是一種潛在的生防真菌，也是控制害蟲的一種有效手段，其引起部分致病效應加快了昆蟲的致死進程。寄生曲霉Q527生長最適培養基為PDA培養基，在pH5.0～12.0范圍內均可生長。乳糖能促進寄生曲霉Q527菌絲生長，可溶性淀粉可有效促進寄生曲霉Q527產孢，蛋白胨作為氮源在生長速度和產孢量都有一定優勢，營養繁殖喜黑暗，黑暗環境能促進其產孢。雖然研究結果表明此曲霉具備防除害蟲的潛力，但對有前途的菌株等開展定性的安全性評價也很有必要，實際的開發利用還有待于進一步開展安全性研究。