不同雜草防除模式對大蔥產量及根際土壤生物學性狀的影響

王帥帥 ，吳人敏，張傳進，楊尚東, 2*

( 1. 廣西大學農學院，廣西 南寧 530004；2. 廣西農業科學院廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】雜草具有數量大、抗逆性強、生長迅速等特點，不僅與農作物爭奪有限的土壤肥力與光照，抑制作物的生長和發育，還會造成病蟲害的發生與蔓延，對農業生產產生嚴重危害[1-2]。目前，防除雜草的方法主要有人工除草、覆蓋地膜和使用化學除草劑等。其中，以聚乙烯烴類為原料的地膜在使用后會大量殘留在土壤中，極易形成持久性污染，對農業可持續發展構成嚴重威脅[3]。化學除草劑亦會長時間地殘留在土壤中，影響農作物產量、品質與食品安全[4]。因此，研究雜草生態防除模式對保護生態環境和提高作物產量具有重要意義。【前人研究進展】土壤微生物在農業生態系統中起著極其重要的作用[5]，土壤微生物群落結構對外界環境條件的變化非常敏感，可以反映環境變化和生態學功能[6]。王棟等[7]研究了水稻覆草旱作和免耕覆草旱作對稻田土壤理化性質和生物學性質的影響，結果發現與常規方法相比，免耕覆草旱作可以顯著提高土壤有機質、全氮、堿解氮和土壤基礎呼吸。謝駕陽等[8]研究了覆草對土壤有機碳氮和生物活性的影響，結果表明覆草能增加土壤有機碳氮的易礦化組分，提高土壤有機質的生物有效性。嚴奉君等[9]發現覆蓋能夠有效促進雜交稻根系的生長，增加干物質與氮素積累以及提高氮肥利用效率。【本研究切入點】有關雜草防除的研究主要集中于地上部分雜草防除效果方面，基于傳統的生物學分析方法與高通量測序技術，探究不同雜草防除模式對大蔥根際土壤生物學性狀的影響的研究尚鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】篩選最佳的雜草防除方法，為建立有效的雜草生態防除模式提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及供試材料

試驗于2017年11月至2018年4月在廣西大學農學院蔬菜生產基地(東經108°18′，北緯22°51.2′)進行。大蔥品種為“攬勝”(購自上海惠和種業公司)；覆蓋木糠購于南寧市白蒼嶺農貿市場。試驗地土壤類型為赤紅壤，土壤pH 5.71，有機質含量8.42 g·kg-1、全氮0.51 g·kg-1、全磷0.67 g·kg-1、全鉀7.21 g·kg-1、堿解氮13.17 mg·kg-1、速效磷0.59 mg·kg-1、速效鉀80.6 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗設3個處理，分別為不除草(CK)、人工除草(T1)和木糠覆蓋(T2)，每個處理3次重復，隨機區組排列，共9小區，每個小區面積15.0 m2(2.5 m×6.0 m)。施肥、灌溉和病蟲害防治均按常規方法相同管理。

1.3 樣品采集

大蔥定植80 d進入采收期后采集土壤樣品。每個處理小區隨機選取5株，連根拔起，依據抖根法[10]采集根際土壤并用無菌袋收集。每份土壤樣品分為2部分，一部分過10目篩后置于4 ℃冰箱保存，用于土壤生物學性狀分析；另一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于細菌多樣性分析。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 產量估算 大蔥產量的估算采用常規計算法，收獲3個處理相應的大蔥，稱重計算單位平方面積大蔥產量，以單位面積產量估算每公頃產量。

1.4.2 生物學性狀分析 利用梯度稀釋平板法測定可培養微生物數量[11]。分別采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基和高氏一號瓊脂培養基培養可培養細菌、可培養真菌和可培養放線菌。

參考李振高[12]以及趙久成[13]稍加改良的實驗方法測定β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶，分別采用氯仿熏蒸提取—容量分析法、氯仿熏蒸提取—茚三酮比色法和氯仿熏蒸提取—磷鉬藍比色法測定土壤中微生物生物量碳、氮和磷[14]。

土壤細菌群落結構分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司測序完成。測序具體流程：DNA抽提和PCR擴增：根據E.Z.N.A.?soil試劑盒 (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)說明書進行總DNA抽提，使用NanoDrop2000檢測DNA濃度和純度，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。用338F和806R引物對V3-V4可變區進行PCR擴增。 Illumina Miseq測序：回收PCR產物(2 %瓊脂糖凝膠)→純化(Extraction Kit)→Tris-HCl洗脫→電泳檢測→檢測定量(QuantiFluorTM-ST)→構建PE 2*300的文庫。構建文庫的步驟如下：①連接“Y”字形連接器；②用磁珠過濾自連接片段；③通過PCR擴增文庫模板；④氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。利用Illumina Miseq測序公司MiseqPE300平臺進行測序(上海美吉生物制藥有限公司)。原始數據上傳到NCBI數據庫進行比較。

ACE指數、Chao指數、Simpson指數和Hiep指數的計算方法和結果均來自上海美吉生物醫藥科技有限公司I-sanger云數據分析平臺(www.majorbio.com)。具體公式如下：

Chao：

其中，Schao1:估計的OTU數；Sobs:實際觀測到的OTU數；n1:只含有1條序列的OTU數目；n2:只含有2條序列的OTU數目。

ACE：

其中，

ni:含有i條序列的OTU數目；

Srare:含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數目；

Sabund:多于“abund”條序列的OTU數目；

abund :“優勢”OTU的閾值，默認為10。

Simpson：

其中，Sobs:實際觀測到的OTU數目；ni:第i個OTU所含的序列數；N: 所有的序列數。

1.5 統計分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0統計軟件進行試驗數據統計分析，并利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-sanger云數據分析平臺進行在線數據分析，構建細菌群落柱形圖和多樣性分析，探究不同雜草防除模式對大蔥根際土壤肥力與健康狀況的影響。

2 結果與分析

2.1 不同雜草防除模式對大蔥產量及根際土壤生物學性狀的影響

2.1.1 不同雜草防除模式對大蔥產量和根際土壤可培養微生物數量的影響 由表1可知，處理T2的大蔥產量顯著高于CK和處理T1(P<0.05，下同)，分別增產了6.5 %和8.0 %，處理T1和CK間差異不顯著(P>0.05，下同)；處理T2大蔥根際土壤中可培養細菌、真菌數量與CK相比分別增加了20.8 %、33.3 %，均達顯著差異水平，但處理T1和T2之間可培養微生物(細菌、真菌和放線菌)數量差異未達顯著水平。此外，處理T1與CK相比，可培養細菌、真菌和放線菌數量雖呈增加趨勢，但兩處理之間差異并未達顯著水平。上述結果表明：與CK相比，處理T2顯著提高了大蔥產量和根際土壤中可培養細菌和真菌數量，但處理T1相應的影響效果不顯著。

2.1.2 不同雜草防除模式對大蔥根際土壤中涉及C、N和P循環相關酶活性的影響 由表2可知，與對照相比，除磷酸酶活性外，處理T2顯著提高了大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶和氨肽酶的活性，分別提高了14.4 %和6.89 %。但處理T1僅顯著提高了大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶的活性，氨肽酶和磷酸酶活性與對照之間無顯著差異。這一結果表明：處理T2比T1更有助于改善大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶和氨肽酶的活性。

2.1.3 不同雜草防除模式對大蔥根際土壤微生物生物量C、N和P的影響 土壤微生物生物量的多少及其變化是土壤肥力高低及其肥力變化的重要依據之一[15-16]。由表3可知，與對照相比，除微生物生物量磷外，處理T2顯著提高了大蔥根際土壤中微生物生物碳和氮，分別提高了3.81和1.37倍，處理T1對土壤微生物生物量的影響呈現與處理T2相似的變化趨勢，該模式對微生物生物量碳和氮的提升效果分別為對照的3.47和1.25倍，與處理T2一樣均顯著高于對照，而且處理T2和T1之間無顯著差異。此外，微生物生物量磷在3個處理中均無顯著差異。結果表明：無論是處理T2亦或是處理T1均有助于提高或保持大蔥根際土壤的微生物生物量碳、氮和磷，有利于提高和保持大蔥根際的土壤肥力。

表1 不同雜草防除模式對大蔥產量及根際土壤可培養微生物數量的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示差異達顯著水平(P<0. 05)，下同。

Note：Values followed by different lowercase letters in the same column are significantly different at 0.05 level. The same as below.

表2不同雜草防除模式對大蔥根際土壤酶活性活性的影響

Table 2 Effects of different mulching treatments on soil enzyme activities in rhizosphere of scallion

(nmol·g-1·min-1, 30 ℃)

表3 不同雜草防除模式對大蔥根際土壤微生物量碳、氮和磷的影響

2.2 基于高通量測序的大蔥根際土壤細菌多樣性分析

2.2.1 根際土壤細菌的Alpha多樣性分析 由表4可知，基于高通量測序技術，3個處理樣品得到的序列數均在3萬條之上，3個樣品中產生的OTU總數量為2094個。其中CK、處理T1和T2分別為1937、1951和1981個。其中OTU數量最多的組合為處理T2，為1981個，最少的是CK，為1937個；本次研究獲得的細菌群落共33個門，75個綱，155個目，283個科，502個屬，958個種。在相似度97 %的分類水平下，基于I-sanger云數據分析平臺計算屬水平不同雜草防除模式下，大蔥根際土壤中細菌的豐富度、多樣性和均勻度指數。ACE指數和Chao指數用于估計群落中OTU數目的指數；此處選取ACE指數和Chao指數來表示物種豐富度，ACE指數和Chao指數排列順序為：T2>T1>CK，表明處理T2的土壤微生物物種豐富度更高；Simpson指數用于估算樣本中微生物多樣性，指數值越大，說明群落多樣性越低；Simpson指數大小順序為：CK>T1>T2，表明CK物種多樣性最低，處理T2的物種豐富度更高；Heip指數用于衡量土壤細菌群落均勻度，指數值越大，說明群落結構更為均衡，Heip指數的排列順序為：T2>T1>CK，表明處理T2的土壤細菌群落結構更均勻；Coverage是指各樣本文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列被測出的概率越高，本試驗中Coverage水平達到了近100 %。綜上所述，處理T2具有提高大蔥根際土壤細菌豐度、多樣性和均勻度的作用。

2.2.2 門分類水平的優勢細菌菌群分析 根據土壤細菌群落柱狀堆疊圖(圖1)，可以直觀呈現兩方面信息，即：每一樣本在某一分類學水平上含有何種細菌和樣本中各種細菌的相對豐度。基于門分類水平發現：雜草不同防除模式下，大蔥根際土壤細菌的優勢菌門有10種，分別為：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門(Planctomycetes)和Latescibacteria。其中，酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在處理T2的根際土壤中分別比對照增加了28.08 %、7.53 %和74.59 %。酸桿菌門細菌是一類基于新分類方法劃分的細菌門，目前已有研究發現酸桿菌具有許多編碼纖維素酶和半纖維素酶的基因[17]。此外，土壤中擬桿菌門細菌主要參與土壤有機質的分解[18]。綠彎菌門細菌屬兼性厭氧微生物，是一類可通過光合作用產生能量的細菌。

表4 不同處理大蔥根際土壤細菌測序序列統計及屬水平多樣性指數

2.2.3 屬分類水平的優勢細菌菌群分析 高通量測序結果基于屬分類水平(圖2)分析發現：不同雜草防除模式下大蔥根際土壤細菌的優勢菌屬(>1 %)主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、類諾卡氏屬(Nocardioides)、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)、酸微菌屬(Acidibacter)、Gaiella、和Chryseolinea10個菌屬。其中，處理T1和T2中假單胞菌屬(Pseudomonas)變化幅度最大，比對照分別減少了486 %、925 %，假單胞菌屬細菌具有降解蛋白質和淀粉的作用[19]；硝化螺旋菌屬細菌廣泛應用于城市污水處理廠進行生物脫氮[20]，鏈霉菌屬細菌廣泛分布于有機物豐富、酸度和含水量適中的土壤中對土壤中復雜有機物的礦化發揮重要作用。Chryseolinea具有降解單糖、二糖、多糖及部分有機酸的作用[21]。

圖1 不同處理大蔥根際土壤細菌門分類水平的相對分布Fig.1 Relative abundance distribution of species in different treatments at phylum level

圖2 不同處理大蔥根際土壤細菌屬分類水平的相對分布Fig.2 Relative abundance distribution of species in different treatments at genus level

3 討 論

土壤中的微生物生物量、酶活性以及微生物多樣性均可作為指示土壤肥力和評價土壤健康狀況的敏感生物學指標[22-24]。不同雜草防除模式影響著大蔥根際土壤中可培養微生物數量，木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中可培養細菌、真菌數量與對照組之間均達到顯著性差異水平，這一結果與前人研究結果一致[25]，表明木糠覆蓋改變了大蔥根際微環境，改善了土壤結構，為微生物創造了良好的生存和繁殖環境。木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶活性顯著高于對照，人工除草和木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中氨肽酶活性亦顯著高于對照，表明人工除草和木糠覆蓋處理促進了大蔥根際土壤中碳和氮的轉化，提高了碳和氮的循環速率，改善了大蔥根際土壤的碳和氮肥力狀況，這一結果與白雪等[26]和李旺霞等[27]的研究結果相似。此外，木糠覆蓋具有常規地膜不具備的優勢，木糠可逐漸被微生物分解，提高了土壤有機質的含量。人工除草和木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中微生物生物量碳、氮顯著高于對照，但微生物生物量磷與對照之間無顯著差異，這一結果與魏靜等[28]研究微生物生物量碳、氮和磷的結果相類似，表明人工除草和木糠覆蓋有利于豐富大蔥根際土壤中的碳和氮庫的儲備量，提高了大蔥根際土壤肥力。與人工除草方式相比，木糠覆蓋處理并未增加土壤中磷的含量，可能是木糠中磷含量不高導致微生物攝入或分解量不高等原因所致。

基于高通量測序結果可知，人工除草和木糠覆蓋模式均有助于提高大蔥根際土壤中細菌豐度、均勻度與多樣性指數，而且木糠覆蓋處理的提升效果更為顯著。此外，與對照相比，人工除草和木糠覆蓋處理雖然沒有顯著改變大蔥根際土壤中優勢細菌的組成，但顯著改變了根際土壤中不同優勢細菌的比例。其中，酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和、擬桿菌門(Bacteroidetes)是木糠覆蓋處理中顯著增加的優勢菌門；假單胞菌屬細菌則是人工除草和木糠覆蓋處理中顯著減少的優勢菌屬。大蔥根際土壤中優勢細菌組成比例的變化可能與人工除草或木糠覆蓋改變了大蔥根際土壤的水分含量、溫度和光照等環境條件緊密相關。

4 結 論

木糠覆蓋防除雜草的模式可以改善大蔥根際土壤的健康狀況，提高大蔥產量，適宜作為南方大田作物生產中雜草生態防控的管理模式進行規模化推廣。