快速老化模型小鼠海馬組織間液中單胺類神經遞質水平的晝夜節律變化和增齡變化

王 靜，程肖蕊，周文霞，張永祥，王淑美

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

快速老化模型小鼠（senescence-accelerated mouse，SAM）由日本京都大學竹田教授經過篩選培育而成，包括快速老化亞系（SAM-prone，SAMP）和抗快速老化亞系（SAM-resistant，SAMR）。SAMP系具有品系特異的病理表型，SAMR系則具有相對正常的生命期，常作為SAMP系的對照。其中SAMP8亞系的特征是中樞學習記憶功能隨增齡進行性快速衰退，與SAMR1亞系相比，SAMP8亞系病理特征明顯且穩定，對藥物治療具有良好的反應。因此，目前SAMP8亞系被認為是研究阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）等老化相關疾病發生機制及其防治藥物的較為理想的動物模型［1］。

神經系統紊亂與學習記憶功能密切相關［2-3］。已有研究表明，SAMP8腦中的神經信號傳遞異常。與同月齡SAMR1相比，12月齡SAMP8海馬中M1受體與其阻斷劑哌侖西平（pirenzepine）、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體與其拮抗劑MK-801、苯二氮類受體與其激動劑氟硝西泮（flunitrazepam）、5-羥色胺1A（5-hydroxytryptamine 1A，5-HT1A）受體與其激動劑8-羥基-2-（雙-n-丙胺基）-四氫萘、蛋白激酶C與其激活劑佛波醇-12，13-二丁酸酯的結合能力下降；而在皮質中，M1受體與其阻斷劑哌侖西平、苯二氮類受體與其激動劑氟硝西泮、5-HT1A受體與其激動劑8-羥基-2-（雙-n-丙胺基）-四氫萘結合能力增加。在SAMP8海馬神經細胞胞質和胞膜中，蛋白激酶C與其激活劑佛波醇-12，13-二丁酸酯的結合能力降低［4］。上述結果提示，SAMP8腦中谷氨酸能和5-HT能神經傳遞發生異常。對于涉及去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）能、多巴胺（dopamine，DA）能和5-HT能單胺類神經遞質，本研究室前期研究發現，SAMP8大腦皮質、海馬和下丘腦內單胺類神經遞質水平多明顯高于同齡SAMR1，且隨增齡明顯增高，提示SAMP8學習記憶能力的衰退可能與其相關腦區單胺類神經遞質水平的變化密切相關［5］。然而對于SAMP8腦中單胺類神經遞質的晝夜節律及其增齡性變化尚缺乏系統的研究。

單胺類神經遞質在神經系統中起著重要的調節作用［6］。為使SAMP8更好地應用于老化相關疾病如AD的發生機制以及防治藥物研究，本研究采用微透析方法獲得主管學習記憶的關鍵部位海馬的組織間液，利用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）-電化學方法測定組織間液中單胺類神經遞質及其代謝產物水平，包括NE、DA及其代謝產物高香草酸（homovanillic acid，HVA）和3，4-二羥基苯乙酸（3，4-dihydroxy phenylacetic acid，DOPAC）、5-HT及其代謝產物5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA），觀察其晝夜節律及增齡性變化，這對于揭示AD等老化相關疾病發生機制及相關藥物藥理學研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

SAMP8和SAMR1由日本京都大學引進，雄性，體質量29.1～50.9 g，共70只，本研究室繁殖飼養。其中，3月齡SAMR1 6只，6，9，12和15月齡均5只，18月齡7只；3和18月齡SAMP8均5只，6月齡8只，9月齡7只，12和15月齡均6只。

NE，DA，DOPAC，HVA，5-HT和5-HIAA標準品及辛烷磺酸鈉均購自美國Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、無水亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和NaCl均購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）購自中國賽默飛世爾科技有限公司；實驗用水為Mili-Q超純水（美國Millipore公司Mili-Q純水機制造）；人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF）購自石家莊四藥有限公司；3，4-二羥基芐胺（3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA）購自美國Sigma公司。Waters e2695液相色譜工作站及電化學檢測器和SunFireTM C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，美國Waters公司）；自發活動箱（400 mm×400 mm×600 mm，上海吉量，JLBehv-LAG-9）；超低溫冰箱（-80℃，海爾公司）；CMA120清醒動物裝置、微注射泵和BAS（2 mm）微透析探針均購自美國BAS公司。

1.2 海馬組織間液樣品采集

小鼠ip給予戊巴比妥鈉70 mg·kg-1，麻醉后開始底座植入手術。將小鼠俯臥固定于立體定位儀上，調整齒夾和耳夾使顱骨面水平。剪開顱骨上皮膚和皮下組織，用3%H2O2浸濕的棉簽燒灼止血并充分暴露顱骨表面，調節門齒桿使前后囟在同一水平面。以橫縱坐標定位前囟，并確定所定位海馬的坐標：前囟后2.7 mm，前囟側3.0 mm，顱骨面下1.5 mm。按上述坐標，垂直插入引導管，并以牙科水泥使之固定于顱骨面；手術完畢后單籠飼養，72 h后透析。

透析前1 d，新的微透析探針（透析膜長度2 mm）浸泡于純水中過夜。將小鼠置自發活動箱中。用乙醚輕微麻醉，小心取出引導管內鋼芯，將探針置入，探針事先通過MF-5366型連接管〔0.025 OD（外徑）×0.005 ID（內徑）〕與微量注射泵和收集器的收集針相連，將微量注射泵的流速調到2 μL·min-1灌流腦脊液代替物（artificial cerebrospinal fluid，aCSF），調節收集器的溫度為4℃。從12∶00開始采樣，每隔4 h采集1個樣品，收集24 h，采樣時間點分別為12∶00，16∶00，20∶00，24∶00及次日4∶00和8∶00，每個樣品35 μL，每收集完1個樣品立即加入6 μL高氯酸溶液1.1 mol·L-1并混勻，以防止遞質被降解，然后保存于-80℃冰箱。

1.3 海馬組織間液神經遞質水平的測定

1.3.1 液相色譜條件

電化學檢測器使用玻璃碳工作電極，固態Ag/AgCl作為參比電極。檢測電壓為+0.70 V。流動相由檸檬酸85 mmol·L-1，無水乙酸鈉100 mmol·L-1，Na2EDTA 0.2 mmol·L-1，辛烷磺酸鈉 0.9 mmol·L-1，NaCl 2 mmol·L-1，15% 甲醇組成，pH值3.70。柱溫8℃，柱壓+0.70 V，流速1.0 mL·min-1，進樣35 μL。

1.3.2 標準曲線制作

用HPLC-電化學法檢測遞質的含量，每次進樣35 μL，以峰面積外標法進行定量。首先分別稱取DA 3.79 mg，5-HT 4.25 mg，NE 3.38 mg，DOPAC 3.36 mg，HVA 3.62 mg，5-HIAA 3.82 mg，分別超聲溶解于2 mL aCSF中配制成10 mmol·L-1的貯存液。隨后，從每種遞質標準品貯存液中各取100 μL合并，再加 aCSF 400 μL 稀釋至1 mmol·L-1；然后用 aCSF 依次稀釋 50 倍至 20 μmol·L-1，再稀釋20倍至1 μmol·L-1，最后再用aCSF依次2倍倍比稀釋至500，250，125，62.5，31.25，15.6，7.8，3.9和1.9 nmol·L-1。取各倍比稀釋液35 μL，分別加內標DHBA 4 μL和1.1 mmol·L-1高氯酸 6 μL，混勻后取35 μL進樣。以單胺類神經遞質峰面積與內標DHBA峰面積的比值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，制作NE、DA及其代謝產物HVA和DOPAC、5-HT及其代謝產物5-HIAA的標準曲線。

1.3.3 單胺類神經遞質及代謝產物水平測定

各時間點濃度的測定：取各時間點采集的樣品35 μL，加1.1 mmol·L-1高氯酸6 μL混勻。測定時向混合液中加內標DHBA 4 μL，混勻后取35 μL進樣。遞質的濃度用遞質峰面積與內標峰面積的比值從上述相應標準品曲線計算獲得。

12∶00至次日8∶00遞質及其代謝產物時間-濃度曲線下面積（area under curve，AUC）計算：計算海馬組織間液中NE、DA及其代謝產物HVA和DOPAC、5-HT及其代謝產物5-HIAA 12∶00至次日8∶00時間-濃度AUC，表示海馬組織間液遞質及其代謝產物晝夜總含量，分析SAMR1和SAMP8海馬組織間液中單胺類神經遞質增齡性變化。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 單胺類神經遞質及其代謝產物標準曲線

采用HPLC-電化學法檢測NE，DA，HVA，DOPAC，5-HT和5-HIAA標準品1.9，3.9，7.8，15.6，31.25，62.5，125，250和500 nmol·L-1溶液峰面積，以峰面積與內標DHBA峰面積的比值為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，制作其標準曲線。NE：y=0.005694x+0.01428（R2=0.9965，P＜0.01）；DA：y=0.008431x+0.001449（R2=0.9959，P＜0.01）；DOPAC：y=0.005029x+0.003377（R2=0.9989，P＜0.01）；HVA：y=0.008840x+0.001874（R2=0.9956，P＜0.01）；5-HT：y=0.003838x+0.03145（R2=0.9988，P＜0.01）；5-HIAA：y=0.001490x+0.01020（R2=0.9994，P＜0.01）。

2.2 SAMR1和SAMP8海馬組織間液中NE水平的變化

2.2.1 晝夜節律變化

結果表明（圖1），12∶00至次日8∶00，SAMP8海馬組織間液中NE濃度的變化，除3月齡與SAMR1一致外，6～18月齡與SAMR1均不一致，其中6和18月齡晝夜節律變化差異更為明顯。6月齡：16∶00 SAMP8 NE濃度明顯低于SAMR1（P＜0.01），隨后逐漸升高，至次日 4∶00～8∶00 SAMP8 明顯高于SAMR1（P＜0.01）。18月齡：12∶00～16∶00 SAMP8 NE濃度高于SAMR1（P＜0.05），20∶00低于SAMR1（P＜0.01），隨后逐漸升高，至次日4∶00又升高于SAMR1（P＜0.01）。

Fig.1 Changes in norepinephrine（NE）concentration in hippocampal interstitial fluid of male senescenceaccelerated prone 8 mice（SAMP8）and SAM resistance 1（SAMR1）detected by HPLC-ECD.A-F：3，6，9，12，15 and 18 months of old，respectively.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same time.

2.2.2 增齡變化

結果表明（圖2），12∶00至次日8∶00，3～18月齡SAMP8海馬組織間液中NE總含量變化趨勢與SAMR1一致，均為3和6月齡較高，隨后隨增齡降低。SAMP8與SAMR1的差異為15月齡SAMP8低于SAMR1（P＜0.05），18月齡SAMP8高于SAMR1（P＜0.05）。

Fig.2 Changes in NE total content in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 with aging detected by HPLC-ECD.AUC：area under curve.±s，n=5-7.＊P＜0.05，compared with SAMR1 of the same age.

2.3 SAMP8和SAMR1海馬組織間液中DA及其代謝產物水平的變化

2.3.1 晝夜節律變化

結果表明（圖3），DA晝夜節律：12∶00至次日8∶00，3～12月齡SAMP8 DA晝夜節律變化與同月齡SAMR1均不一致，幾乎相反。DOPAC晝夜節律：除15和18月齡其濃度低于檢測限，3～12月齡SAMP8 DOPAC濃度與同月齡SAMR1晝夜節律變化亦不一致；特別是3和9月齡，SAMP8與SAMR1幾乎相反。HVA晝夜節律：3，6，9和18月齡SAMP8 HVA濃度變化與同月齡SAMR1均不一致，12和15月齡晝夜節律變化相似。

2.3.2 增齡變化

結果表明（圖4），3～12月齡SAMP8 DA總含量隨增齡變化趨勢與SAMR1相似，差別是SAMP8 3月齡高于SAMR1（P＜0.05），6月齡低于SAMR1（P＜0.05）。SAMP8 DOPAC總含量的增齡變化趨勢與SAMR1一致，差別是12月齡SAMP8低于SAMR1（P＜0.05）。SAMP8 HVA總含量的增齡變化趨勢除3月齡外基本一致，差別是3和12月齡高于SAMR1（P＜0.01），18月齡低于SAMR1（P＜0.05）。

Fig.3 Changes in concentrations of dopamine(DA),3,4-dihydroxy phenylacetic acid(DOPAC)and homovanillic acid(HVA)in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 detected by HPLC-ECD.A-D:DA of 3,6,9 and 12 months old,respectively;E-H:DOPAC of 3,6,9 and 12 months old,respectively;I-N:HVA of 3,6,9,12,15 and 18 months old,respectively.±s,n=5-7.＊P＜0.05,＊＊P＜0.01,compared with SAMR1 of the same time.

Fig.4 Changes in total contents of DA（A），DOPAC（B）and HVA（C）in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 with aging detected by HPLC-ECD.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same age.

2.4 SAMP8和SAMR1海馬組織間液中5-HT及其代謝產物水平

2.4.1 晝夜節律變化

結果表明（圖5），5-HT晝夜節律：12∶00至次日8∶00，SAMP8 5-HT晝夜變化除12月齡與SAMR1一致外，其余月齡均不一致，特別是9，15和18月齡與SAMR1幾乎相反；5-HIAA晝夜節律：3～15月齡SAMP8 5-HIAA濃度變化與同月齡SAMR1均不一致，特別是3，6和9月齡幾乎相反。

2.4.2 增齡變化

結果表明（圖6），3～18月齡SAMP8 5-HT總含量增齡變化趨勢，除18月齡外（P＜0.05），與SAMR1基本一致；3～15月齡SAMP8 5-HIAA總含量增齡變化趨勢，除6月齡外，與SAMR1基本一致，差別是6，9，12和15月齡SAMP8高于SAMR1（P＜0.05）。

Fig.5 Changes in concentrations of serotonin（5-HT）and 5-hydroxyindoleacetic acid（5-HIAA）in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 detected by HPLC-ECD.A-F：5-HT of 3，6，9，12，15 and 18 months old，respectively；G-K：5-HIAA of 3，6，9，12 and 15 months old，respectively.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same time.

Fig.6 Changes in total contents of 5-HT（A）and 5-HIAA（B）in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 with aging detected by HPLC-ECD.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same age.

3 討論

單胺類神經遞質中NE與焦慮抑郁相關，5-HT與情緒相關，DA能神經系統則在快感與行為動機方面起著極其重要的作用［7］，因此一直受到科學研究的關注。在人體以及嚙齒類動物的大腦內5-HT，DA和NE含量的研究很多，同時也出現了不少難以解釋的矛盾性結果。如在人體，5-HT和NE含量在皮質、海馬、基底神經節和腦干部位隨增齡保持穩定［8-11］。也有報道稱，因從尸檢大腦得到的單胺檢測結果易受死亡時間、解剖時間間隔等影響［12-13］。在腦區5-HT能神經元5-HT水平隨增齡變化報道不一，有的報道不變［3，14-15］，有的報道下降［16-17］，也有報道增加［18-19］。在嚙齒類動物，Godefroy等［20］以3，10和27月齡SD大鼠為研究對象，檢測皮質和紋狀體部位DA及其代謝產物增齡性變化。結果發現，軀體運動皮質部位DA水平隨增齡性增加，顳葉皮質部位則降低。前邊緣皮質、梨狀皮質和顳葉皮質部位HVA水平隨增齡性降低，3-甲氧酪胺（3-methoxytyramine，3-MT）在前邊緣皮質、梨狀皮質、扣帶回區域和顳葉皮質部位增加。紋狀體部位DA和HVA水平降低，但3-MT水平不變。3和27月齡大鼠皮質區域NE增加。DA代謝產物HVA和3-MT水平的變化表明，DA的釋放在某些皮質區域隨增齡增加。由此提示，單胺及其代謝產物在大鼠皮質區域并未完全呈年齡依賴性降低變化，但卻是一個復雜的、區域特定性的變化。本研究結果表明，SAMP8海馬組織間液中NE、DA及其代謝產物DOPAC和HVA、5-HT及其代謝產物5-HIAA水平的晝夜節律發生紊亂，增齡性變化與SAMR1基本相似，與上述研究結果不完全一致，可能原因是研究部位不同［20］。如有研究報道，年老大鼠和年輕大鼠相比，前額皮質和隔膜部位3，4-二羥苯基乙二醇（3，4-dihydroxyphenylglycol，MHPG）和MHPG/NE比例降低；隔膜部位DA和DOPAC水平增加，但DOPAC/DA比例降低。紋狀體部位MHPG/NE比例增加，DOPAC水平增加，海馬和丘腦部位5-HIAA水平增加，表明在衰老早期大腦單胺神經系統單胺類神經遞質隨部位選擇性改變［21］。

已有多項研究結果表明，AD患者5-HT能、DA能和NE能系統發生異常改變，并導致記憶力減退、抑郁和注意力不集中［22-24］。β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）/早老素1（presenilin 1，PS1）轉基因小鼠是家族型AD的動物模型，Von Linstow等［25］以6，12，18和24月齡B6C3 WT小鼠及14和18月齡APP/PS1轉基因小鼠為研究對象，通過HPLC方法檢測新皮質區域、海馬、紋狀體、腦干和小腦部位5-HT，DA和NE含量。結果發現，WT小鼠隨增齡單胺水平無變化，但18月齡轉基因小鼠與WT小鼠相比，單胺水平呈區域特定性的改變，新皮質區域5-HT，DA和NE分別下降了30%，47%和32%；腦干部位5-HT增加了18%。新皮質區域，14月齡APP/PS1轉基因小鼠與其WT小鼠相比，無顯著性差異。同時發現，5-HT，DA和NE增齡性變化無顯著性差異［25］。SAMP8是研究散發型AD發病機制的一個良好模型［1］，為揭示其中樞學習記憶功能障礙的機制，本研究團隊前期檢測了腦組織裂解液中單胺類神經遞質的水平，發現SAMP8多明顯高于同齡SAMR1，且隨增齡明顯增高［5］。除此之外，目前尚未見對SAMP8腦內單胺類神經遞質水平進行細致研究的報道。本研究系統研究了SAM小鼠海馬組織間液中單胺類神經遞質及其代謝產物水平的晝夜節律及增齡性變化，為該模型小鼠的進一步應用奠定了基礎。