NO濃度對小白菜生長和品質的影響

盧 琪，宋天琦，潘 維，徐茜茹，吳蔡楠，宋必秀，都韶婷

（浙江工商大學環境科學與工程學院，浙江杭州 310018）

隨著人們生活水平的提高和工農業的迅速發展，全球氮氧化物排放量大幅增加，大氣氮氧化物濃度日益攀升[1]。大氣氮氧化物已成為一類典型的污染物[2-3]。He等[4]對北京城郊空氣監測發現其氮氧化物濃度高達100～200 nL/L；Zou等[5]在廣州城郊監測的氮氧化物濃度為22～76 nL/L；Xiang等[6]在成都郊區監測的氮氧化物濃度為50～119 nL/L。眾所周知，大氣中的氮氧化物主要由二氧化氮 (NO2) 和一氧化氮 (NO) 組成。NO2的比例較高，且對生物的毒性較大。目前，關于大氣氮氧化物環境效應的研究主要集中于與NO2相關的研究[7-9]。而作為氮氧化物主要成分之一的NO，因其廣泛參與了植物生長發育的調控過程[10]，以往對它的研究主要著重其信號調控機制，而對大氣NO濃度變化的環境生物效應的研究則幾乎屬于空白。

實際上，NO作為一種廣泛參與植物體各種生理活動的重要信號分子，如調控組織器官的發育[11-12]及養分吸收利用[13]等，其在大氣中的濃度變化很可能對植物的生長產生較大影響。至今，已有許多研究證明適量提高植物體內NO濃度對植物生長有益，如水培番茄培養液中添加100或300 μmol/L的NO供體能顯著增加鹽脅迫下番茄的根長與葉片中的葉綠素含量[10]；1 mmol/L NO供體能顯著提高黃瓜的耐寒性[14]；NO供體濃度為50 μmol/L能降低鎘對水稻的脅迫[15]。然而，用于上述研究的NO均來源于NO的化學試劑型供體 (如硝普鈉SNP、二醇二氮烯翁NONOate等)。這些NO供體均作用于植物的根系，且其濃度受其釋放動力學及環境條件等多方面因素的影響[16]，因而無法利用化學型供體的研究結果來直接推測不同濃度氣態NO對植物的影響。因此，若想了解大氣NO濃度變化對植物生長及品質的影響，迫切需要開展以氣態NO為供體的研究。此外，本課題組以往研究已證實200 nL/L的NO氣體對菠菜的生長具有一定促進作用[17]，具備一定的農業應用前景。但植物對更低濃度或更高濃度NO氣體的生長響應特征尚未明確。因此，研究不同濃度NO氣體對植物生長的影響，無論是生態還是農業生產角度，均具有十分重要的意義。綜上，本文將以常見且典型的蔬菜—小白菜為研究對象，采用密閉體系內土培的種植方式，開展不同NO氣施濃度(100、200和400 nL/L) 對其生長、營養及抗氧化品質的影響，以期為污染生態和農業生產提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試土壤及植物

供試土壤取自浙江杭州近郊區菜園表層土壤(0—40 cm)。土壤pH、電導率、陽離子交換率、銨態氮和硝態氮按鮑士旦[18]的方法測定。土壤基本理化性質如下：pH 7.2、電導率0.70 mS/cm、銨態氮2.50 mg/kg、硝態氮13.4 mg/kg、陽離子交換率7.90 cmol/kg。盆栽作物為小白菜 (Brassica chinensisL., 上海青)。

1.2 盆栽處理

相同大小的小白菜種子經0.1% 過氧化氫表面消毒20 min后，用蒸餾水沖洗，于室溫下浸泡過夜。隨后，轉移至土壤中培養至發芽。幼苗長至雙葉齡(大約播種后20 d) 后間苗，保留長勢一致的幼苗，每盆4株。隨后參考Du等[19]的方法對密閉體系注射經氮氣稀釋的NO氣體，使處理體系內NO終濃度分別為0、100、200和400 nL/L。經測定，注射氣體3 h后，NO含量約為初始的80%～90%；12 h后，NO含量約為初始的60%～70%。因此，本試驗于每日清晨換氣，并更新NO氣體。培養期間密閉體系內CO2濃度按于承艷等[20]的方法維持于 (350 ± 30) μL/L左右。培養過程中通過補充去離子水保持土壤含水量于60%左右。移栽約2個月后收獲，拍照后稱重并測下述指標。

1.3 測定指標及方法

硝酸鹽含量的測定參考李合生[21]的方法，即選取小白菜地上部樣品加入蒸餾水后沸水加熱30 min，取部分提取液與5%水楊酸-濃硫酸 (w/v) 溶液充分混勻。室溫放置20 min后，加入NaOH溶液。待冷卻至室溫后，于410 nm波長下測定吸光度。可溶性糖含量用硫酸-蒽酮比色法測定[22]。可溶性蛋白含量按考馬斯亮藍法測定[23]。總酚含量參考Jin等[24]方法，采用福林酚比色法測定。總黃酮參考Dewanto等[25]的方法用95%乙醇 (v/v) 提取后加入30%乙醇溶液和5%NaNO2溶液。5 min后加入10%Al(NO3)3溶液，靜置5 min。隨后加入1 mol/L NaOH，充分反應后于510 nm下比色測定。抗壞血酸含量按Gupta和Prakash[26]的方法，用2, 6-二氯苯酚-靛酚鈉鹽滴定法測定。

1.4 數據統計與分析

本研究所有生理生化指標測定均重復3次。所得數據和圖表用Excel和Kyplot軟件處理。

2 結果與分析

2.1 不同外源NO濃度對小白菜生物量的影響

如圖1所示，外施NO氣體顯著促進了小白菜地上部的生長。與對照相比，NO處理下的小白菜的生物量明顯增加，其中以100 nL/L NO處理下小白菜個體增加最為明顯。就數值而言，100、200和400 nL/L NO處理下的小白菜鮮重分別比對照增加了64%、42%和10% (圖1)，說明外源氣施NO可促施小白菜生物量的提高。但隨著NO處理濃度的增加，其促進生長的效果逐漸下降，400 nL/L NO處理下植物的鮮重與對照無顯著差異。與鮮重類似，NO氣體處理也促進了植物干物質的積累。其中，NO處理濃度為100 nL/L時，小白菜干重增加幅度最高，比對照增加了88%。隨著NO處理濃度的增加，雖然NO對干重的促進效果逐漸下降，但與對照相比200和400 nL/L NO處理下小白菜的干重仍然分別增加了61%和49%。因此，外源施加低濃度氣體NO (100～400 nL/L) 能夠顯著提高小白菜的生物量，并以100 nL/L時的促進效果最佳。

2.2 不同外源NO濃度對小白菜營養品質的影響

人體攝入的硝酸鹽可被還原為亞硝酸鹽，對人體健康構成威脅[27]。由于人體攝入的硝酸鹽有72%～94%來自于蔬菜[28]，因而蔬菜中的硝酸鹽含量備受關注，并成為蔬菜營養品質的重要指標之一。本研究中，隨著外源氣體NO處理濃度的增加，小白菜葉片和葉柄中的硝酸鹽含量均有大幅度下降。其中，100、200和400 nL/L NO處理下葉片硝酸鹽含量分別比對照減少了59%、76%和94%，在葉柄中則分別下降了26%、25%和67% (圖2)。上述結果表明，外源NO氣體的施加能夠顯著降低小白菜體內的硝酸鹽含量，并在本研究設置的NO處理濃度內呈濃度-劑量效應。

可溶性糖含量與蔬菜的口感及營養直接相關，也是一個重要的品質指標。與對照相比，100、200和400 nL/L NO氣體處理的小白菜葉片可溶性糖含量分別是對照的3.1、2.2和2.3倍 (圖3A)。外源氣體NO也增加了小白菜葉柄中的可溶性糖含量，使其可溶性糖含量提高了210%、170%和120% (圖3B)。總體而言，施加100 nL/L NO時其含量的增幅最大。隨著處理濃度的提高，NO氣體對可溶性糖含量的促進效果逐漸降低。200 nL/L與400 nL/L處理時的效果無顯著性差異。上述結果表明，外源施加NO氣體有利于小白菜葉片和葉柄中可溶性糖含量的積累，并以100 nL/L時的促進效果最佳。

圖 1 不同外源NO氣體濃度對小白菜生長的影響Fig. 1 Effects of different exogenous NO gas levels on the growth of pakchoi

圖 2 不同外源NO氣體濃度對小白菜硝酸鹽含量的影響Fig. 2 Effects of different exogenous NO gas levels on the nitrate concentrations of pakchoi

圖 3 不同外源NO氣體濃度對小白菜可溶性糖含量的影響Fig. 3 Effects of different exogenous NO gas levels on the soluble sugar concentrations of pakchoi

蛋白質含量也是衡量蔬菜營養品質的重要指標。與對照相比，100 nL/L NO氣體處理下小白菜葉片中可溶性蛋白含量增加了78%。隨著處理濃度的進一步提高，200和400 nL/L NO處理下小白菜葉片中可溶性蛋白含量分別增加了70%和67% (圖4A)。以上結果表明，外源NO氣體的施加對葉片可溶性蛋白含量均有促進作用，且3個濃度處理對該指標的促進效果無顯著差異。NO氣體處理對葉柄中的可溶性蛋白含量影響與葉片類似，施加100、200和400 nL/L NO氣體分別使其增加了23%、22%和23% (圖4B)。與葉柄的數值相比，外源施加NO氣體促進葉片可溶性蛋白積累的幅度更大。

2.3 不同外源NO濃度對小白菜抗氧化性品質的影響

蔬菜中的抗氧化物含量也是評價其品質的重要指標。由于總酚含有多羥基結構，能夠起到清除自由基的作用[29]，因而其含量是植物抗氧化品質參考標準之一。與對照相比，施加100、200和400 nL/L NO氣體使小白菜葉片總酚含量分別增加了8%、26%和19% (圖5A)，說明外源NO氣體的施加對葉片總酚含量有促進作用。100 nL/L NO處理濃度對小白菜葉柄中總酚含量無明顯影響，但當NO濃度增至200 nL/L和400 nL/L時，葉柄中總酚含量顯著提高了79%和61% (圖5B)。這表明外源NO氣體能夠促進小白菜葉片和葉柄中總酚含量的積累，并以200 nL/L時的促進效果最佳。

圖 4 不同外源NO氣體濃度對小白菜可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effects of different exogenous NO gas levels on the soluble protein concentrations of pakchoi

圖 5 不同外源NO氣體濃度對小白菜總酚含量的影響Fig. 5 Effects of different exogenous NO gas levels on the total phenol concentrations of pakchoi

總黃酮能夠減少自由基形成[30]，也是一個重要的抗氧化品質指標。與對照相比，施加100、200和400 nL/L NO氣體使小白菜葉片總黃酮含量分別增加了13%、46%和32% (圖6A)，這說明NO氣體對葉片中總黃酮含量的促進效果先上升后降低。同時施加100、200和400 nL/L NO氣體處理使葉柄中總黃酮含量分別增加了29%、64%和57% (圖6B)，其中200和400nL/L的處理效果間無顯著差異。這表明外源NO氣體能夠促進葉片和葉柄中總黃酮的積累，其中施加200 nL/L左右的NO時其含量的增加最為顯著。

抗壞血酸又稱維生素C，是人體必需的主要維生素之一[31]。與對照相比，施加100、200和400 nL/L NO氣體使小白菜葉片抗壞血酸含量分別增加了22%、14%和15% (圖7A)。上述結果表明，外源NO氣體的施加對葉片抗壞血酸有顯著促進作用，但3個濃度處理對葉片抗壞血酸含量的促進效果無顯著差異。此外，100、200和400 nL/L NO氣體也使葉柄中抗壞血酸含量分別增加了43%、60%和180%(圖7B)。這表明，外源施加NO氣體有利于小白菜葉片和葉柄中抗壞血酸含量的積累。

3 討論

與其它化學型NO供體的研究結果類似[32-33]，外源NO氣體的施加也會顯著改變小白菜的生長。本研究發現氣態NO可使小白菜鮮重及干重均有一定程度的增加 (圖1)，說明100～400 nL/L的NO濃度有利于植物的生長。考慮到目前大氣中NO尚低于本研究設置的濃度[4-6]，因而就植物生理生態角度而言，近幾十年內大氣NO濃度的持續增加有利于小白菜的生長。就農業生產角度而言，隨著近年來蔬菜大棚的普及，外源施加NO氣體對增加小白菜生物量具有一定的應用前景。汽車尾氣NO的濃度通常為0.5～1.0 × 106nL/L[34]；農用車發動機NO排放量為0.39～0.43 × 106nL/L[35]。由此可見，本研究設置的NO濃度低于發動機的日常排放量。然而，大棚中氣施NO的農業行為是否存在潛在的環境風險仍應在今后的研究中進行評估。另一方面，許多基于NO化學試劑型供體的研究曾指出NO的植物生理效應呈多樣性，與其濃度直接相關[16]。如供試植物為黃瓜時，適宜的SNP處理濃度為100 μmol/L[36]；而當供試植株為番茄時，SNP的適宜濃度為10 μmol/L[37]。因此，雖然100 nL/L NO對小白菜生長的促進效果較佳 (圖1)，但鑒于不同植物品種間不同的生理結構和特性，其它植物氣施NO的適宜濃度也可能存在差異。因此，今后可進一步研究外源NO氣體的施加對不同植物影響的差異性。

圖 6 不同外源NO氣體濃度對小白菜總黃酮含量的影響Fig. 6 Effects of different exogenous NO gas levels on the total flavonoids concentrations of pakchoi

圖 7 不同外源NO氣體濃度對小白菜抗壞血酸含量的影響Fig. 7 Effects of different exogenous NO gas levels on the ascorbate concentrations of pakchoi

本研究中，外源NO氣體的施加有效降低了小白菜體內的硝酸鹽含量 (圖2)。本課題組先前的研究也已證實低濃度NO供體SNP可促進硝酸鹽代謝關鍵限速酶——硝酸還原酶 (nitrate reductase，NR) 的活性[38]。因此，本研究中氣施NO處理也可能通過提高NR活性從而減少植物體內硝酸鹽的積累。參考SNP處理小白菜NR的研究結果 (SNP處理濃度升至60 μmol/L后抑制NR活性)[38]，而本研究中小白菜體內的硝酸鹽含量與NO處理濃度仍呈劑量-效應關系(圖2)，說明NO氣施濃度400 nL/L可能尚未超出促進NR活性的范圍。此外，也有研究指出NO對NR的影響與供氮水平相關[39]，即低氮和高氮條件下NO對植物NR活性的影響呈相反的作用。本研究的供試土壤未經施肥處理，這也可能是400 nL/L NO氣施濃度持續降低小白菜體內硝酸鹽含量的重要原因。另外，本研究中100 nL/L NO處理也使小白菜可溶性糖與可溶性蛋白含量顯著增加 (圖3)。這表明氣施NO在促進小白菜生長的同時，還提高了小白菜的營養品質，這可能與NO促進碳、氮同化有關[40-41]。此外，本研究中氣態NO對小白菜的抗氧化物質均有一定程度的促進 (圖4～圖7)。就總酚和總黃酮而言，100 nL/L的氣態NO對小白菜葉片中的總酚、總黃酮含量的提升效果已達顯著水平，隨著處理濃度的提高其促進作用先升后降，該變化趨勢與化學型NO供體研究類似[42-43]。并以施加200 nL/L的氣態NO對小白菜葉片和葉柄的總酚和總黃酮含量提升效果最佳。就抗壞血酸而言，100 nL/L氣態NO對葉片抗壞血酸含量的促進效果最佳，而葉柄中的抗壞血酸含量呈濃度-劑量效應 (400 nL/L NO處理效果最佳)。有報道指出，SNP對植物葉片抗壞血酸酶學系統活性的影響表現為先促進 (0～400 μmol/L)后抑制 (400～1000 μmol/L)的趨勢，而其在葉柄中則表現為持續被誘導[44]，這可能是葉柄中抗壞血酸含量持續升高的可能原因之一。綜合上述3個抗氧化物含量指標，200 nL/L外源NO氣體是提高小白菜抗氧化品質的較佳施加濃度。同時，我們也應注意，由于不同植物的生理特性差異，外源NO氣體對其它作物體內抗氧化物質積累的程度可能存在一定差異。

4 結論

外源氣施0～400 nL/L濃度的NO均能顯著促進小白菜的生長并提高其品質。其中，NO氣施濃度為100 nL/L時，NO對小白菜生物量、可溶性糖以及可溶性蛋白含量提高效果最佳；而較高濃度的

NO對小白菜硝酸鹽的降低和對總酚、總黃酮和抗壞血酸含量的提升效果較佳。因此，可根據不同需求，選擇不同施加濃度進行大棚內小白菜的種植，以提高小白菜的產量和食用價值。值得注意的是，本研究僅采用模擬大棚，不能完全代表實際大棚的種植條件，因此建議今后進一步開展大棚試驗。