無乳鏈球菌中可接合性轉移元件的檢測及攜帶菌株的分子流行特征調查

朱東安， 周凱鑫， 常 東， 孫景勇

無乳鏈球菌亦稱為B族鏈球菌（group BStreptococcus），常可引起肺炎、泌尿系統感染、軟組織感染等，無乳鏈球菌也是女性泌尿生殖道的一種重要條件致病菌，可垂直傳播感染胎兒，也是嬰兒早期嚴重感染的主要原因[1]。臨床上無乳鏈球菌對青霉素具有高度敏感性，而對于青霉素過敏的患者克林霉素、紅霉素或左氧氟沙星是重要的替代用藥，但無乳鏈球菌對這些藥物具有較高的耐藥率[2]。通常認為耐藥質粒的傳播是細菌耐藥性播散的重要機制，然而近年來隨著測序技術的發展，很多測序結果顯示一種廣泛存在于細菌中的可接合性轉移元件（ICE）也在細菌耐藥性的轉移過程中扮演了重要角色[3]。

本研究將對分離自臨床標本中的無乳鏈球菌進行ICE檢測并對ICE陽性菌株的耐藥性和分子流行特征進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2017年8月－2018年4月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院微生物科臨床分離的無乳鏈球菌178株（剔除重復株），其中分離自尿路感染患者中段尿117株（86株來自門診患者，31株來自住院患者）、陰道分泌物45株（來自孕前篩查孕婦）、前列腺液12株（來自門診患者），血培養4株（來自住院患者）。接合試驗受體菌為1株分離自臨床的無乳鏈球菌（sag158），其對紅霉素敏感、對左氧氟沙星耐藥，經三代全基因組測序證實其不含ICE 結構，多位點序列分型（MLST）分型為ST-19型（GenBank： CP019979）[4]。

1.1.2 主要試劑和儀器 藥敏紙片為英國OXOID公司產品；細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增試劑為天根生化科技（北京）有限公司產品；VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統為法國生物梅里埃公司產品；Thermal Cycler PCR 儀和CHEF-DR Ⅲ脈沖場凝膠電泳儀為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定及DNA模板提取 收集的菌株由VITEK MS全自動快速微生物質譜檢測系統進行無乳鏈球菌確認鑒定。從孵育18～24 h的血瓊脂培養基上挑取10～12個菌落通過細菌基因組DNA提取試劑盒提取臨床分離的無乳鏈球菌基因組DNA備 用。

1.2.2 篩選可能攜帶ICE的菌株 以PCR方法篩選無乳鏈球菌中ICESa2603家族ICE的酪氨酸重組酶基因tyr及其特異性插入位點基因rplL，引物根據GenBank上公布的序列自行設計。以PCR方法篩選無乳鏈球菌中類ICESa2603家族ICE的絲氨酸重組酶基因SR以及其特異性插入位點基因rumA，引物根據GenBank上公布的序列自行設計。見表1。擴增產物測序結果通過BLAST與GenBank上公布的tyr、rplL基因，SR、rumA基因進行比對。

表1 ICE PCR擴增引物Table 1 The primers used in ampli fication of ICEs

1.2.3 MLST 根據Jones等[5]撰寫的無乳鏈球菌MLST操作方案設計引物，通過PCR擴增無乳鏈球菌的7個管家基因：adhP、pheS、atr、glnA、sdhA、glcK、tkt。PCR擴增產物委托上海邁浦有限公司測序，測序結果與PubMLST數據庫進行比對，獲得各管家基因位點的等位基因數值，并形成相應的等位基因譜，判斷其ST型。

1.2.4 脈沖場凝膠電泳（PFGE） 根據Elliott等[6]發表的無乳鏈球菌PFGE操作方案，將包埋有細菌DNA的膠塊經裂解、用限制性內切酶SmaI處理后電泳，電泳參數為電壓6 V/cm，夾角120°，溫度14 ℃，電泳時間18 h，沙門菌H9812作為分子量標 準。

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片擴散法對無乳鏈球菌菌株進行藥敏試驗，根據 CLSI 2018年標準判讀結果，藥敏結果采用WHONET 5.6軟件進行分析，耐藥率比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

1.2.6 接合試驗 根據ICE篩選陽性的臨床無乳鏈球菌的藥敏試驗結果，選擇其中15株對紅霉素耐藥、左氧氟沙星敏感的菌株作為受體菌，無乳鏈球菌sag158（紅霉素敏感、左氧氟沙星耐藥，見菌株來源）作為受體菌進行接合試驗，具體方法見文獻 [4] 。挑取在雙抗性平皿（含有紅霉素和左氧氟沙星）上單個生長菌落，進行菌種鑒定、PFGE、 藥敏試驗、PCR檢測ICE重組酶基因及MLST分型以判斷接合試驗是否成功。

2 結果

2.1 無乳鏈球菌中ICE的檢測

通過PCR篩選不同類型ICE的插入位點以及整合酶基因，結果發現178株無乳鏈球菌中27株（15.2%）攜帶ICE（tyr、rplL基因陽性或/和SR、rumA基因陽性）。其中屬于ICESa2603家族的有14株（7.9%）（tyr和rplL基因陽性）；屬于類ICESa2603家族的有19株（10.7%）（SR和rumA基因陽性）；兩類ICE篩選皆為陽性的有6株（3.4%）（tyr、rplL基因和SR、rumA基因均陽性）。

2.2 MLST分型

本研究通過PCR擴增無乳鏈球菌的7個管家基因將27株攜帶ICE的菌株分為9種ST型別，其中ST-12型10株（37.0%），ST-27型4株（14.8%），ST-24型3株（11.1%）， ST-19型3株（11.1%），ST-17型2株（7.4%），ST-10型2株（7.4%），另外ST-41、ST-164、ST-15型各1株（3.7%）。

2.3 藥敏試驗結果

所有178株無乳鏈球菌對青霉素均敏感，對紅霉素、克林霉素、四環素和左氧氟沙星的耐藥率分別為56.2%、41.6%、77.5%和34.3%，其中27株ICE陽性的無乳鏈球菌對上述4種抗菌藥物的耐藥率分別為77.8%、59.3%、92.6%和14.8%；151株ICE陰性的無乳鏈球菌對上述4種抗菌藥物的耐藥率分別為52.3%、38.4%、74.8%和37.7%。見表2。

表2 攜帶ICE和非攜帶ICE的無乳鏈球菌對抗菌藥物的耐藥率Table 2 Antibiotic resistance of ICE-carrying and non-ICE-carrying S. agalactiae（%）

2.4 接合試驗結果

藥敏結果顯示15株紅霉素耐藥ICE陽性的臨床無乳鏈球菌中，10株菌成功地發生了紅霉素耐藥性接合轉移，見表3；PFGE結果顯示10株結合子的PFGE分型與受體菌（sag158）一致而與供體菌（臨床菌株）不同，見圖1；PCR檢測重組酶基因及結合子MLST分型證實這10株結合子中均含有相關供體菌中的重組酶基因，且結合子的ST分型與受體菌（sag 158）一致（均為ST-19）而與供體菌的臨床菌株不同（7株ST-12，3株ST-27）。見表4。

3 討論

目前研究發現在鏈球菌（包括無乳鏈球菌）中與耐藥性相關的ICE主要為ICESa2603家族和類ICESa2603家族兩類[7-8]。ICESa2603是首次在無乳鏈球菌 2603 V/R中發現，其大小為54 kb左右[9]，隨后，在來自歐洲和亞洲的動物及人類臨床分離的鏈球菌中檢測到ICESa2603家族中的其他ICE成員，由此推斷ICESa2603家族的成員在鏈球菌屬中已經播散存在并且能夠在鏈球菌屬中水平轉移[8]，隨著測序技術的發展，其數量及宿主范圍可能會進一步擴大。

ICESa2603家族的ICE包含30個保守的核心基因，在基因結構間有3個位點，用于在所有ICE中插入可變DNA。ICESa2603家族編碼酪氨酸整合酶基因tyr，其在宿主菌的特異性插入位點為染色體上rplL基因。而類ICESa2603家族的ICE含有ICESa2603家族的大部分核心基因（30個中的28個），但它們編碼絲氨酸整合酶基因SR，其在宿主菌的特異性插入位點為染色體上rumA基因[7]。本研究通過PCR篩選這兩類ICE家族中特定整合酶基因（tyr和SR）及其特異性插入位點基因（rplL和rumA）了解臨床分離的無乳鏈球菌中ICE的流行情況，結果顯示兩類ICE家族的總檢出率達15.2%

（27/178），其中ICESa2603家族為7.9%，類ICESa2603家族為10.7%，有6株（3.4%）同時攜帶有兩個家族的ICE，說明ICE在無乳鏈球菌中有一定的分布，需要引起我們的注意。

表3 10株接合成功的紅霉素耐藥無乳鏈球菌及其受體菌、接合子的藥敏結果Table 3 Antibiotic susceptibilities of 10 erythromycin-resistant S. agalactiae strains and their transconjugants

圖1 部分接合成功的無乳鏈球菌及受體菌、接合子的PFGE結果Figure 1 PFGE patterns of some S. agalactiae donor strains， recipients， and their transconjugants

表4 10株接合成功無乳鏈球菌及其受體菌、接合子MLST分型和ICE整合酶PCR結果Table 4 MLST typing and PCR detection of integrase genes in 10 S. agalactiae strains and their transconjugants

MLST結果表明，在本研究ICE陽性的無乳鏈球菌中主要的克隆型為ST-12型（37.0%），其次為ST-27型（14.8%）、ST-24型（11.1%）和ST-19型（11.1%）。而來自上海、廣州和北京的研究均顯示臨床分離的無鏈球菌（未區分是否攜帶ICE）其MLST分型主要為ST-19型[10-12]，由于本研究未對ICE陰性無乳鏈球菌進行MLST分型的檢測，且ICE篩選陽性菌株的總樣本量較少，ICESa2603家族和類ICESa2603家族中的ICE在無乳鏈球菌中的分布與ST-12型克隆菌株是否具有相關性，還需進一步探討。

ICE能夠自身編碼重組和接合轉移所需的全部功能，并攜帶多樣化附屬功能基因（如抗生素和重金屬抗性基因、毒力基因等）從供體菌的染色體自身切割環化后接合重組到受體菌染色體某些特定或非特定區域[3]。ICESa2603家族和類ICESa2603家族的ICE可變區中往往攜帶耐重金屬、紅霉素、四環素及氨基糖苷類等藥物的基因，如erm(B)、tet(O)、aphA等[7]，目前已報道的這兩類攜帶上述耐藥基因的ICE大多數經體外試驗證實是可接合轉移的，從而可能導致臨床菌株耐藥性擴散。如本研究的接合試驗顯示：所選取的15株ICE陽性且紅霉素耐藥的臨床無乳鏈球菌中，有10株可發生ICE和紅霉素耐藥性的同時接合性轉移，而在前期研究中我們對其中的1株供體菌（sag37）及其結合子進行了染色體高通量測序分析，首次發現報道了一種新的類ICESa2603家族的ICE，ICE sag37，該ICE插入在染色體上且同時攜帶有紅霉素、四環素及氨基糖苷類耐藥基因[7]。另外，本研究通過比較攜帶ICE菌株和非攜帶ICE菌株的藥敏情況發現，前者對紅霉素、克林霉素和四環素的耐藥率（分別為77.8%、59.3%、92.6%）均顯著性高于后者（分別為52.3%、38.4%、74.8%），P＜0.05，這進一步證實ICE在臨床分離無乳鏈球菌對紅霉素、克林霉素和四環素的耐藥擴散中可能扮演了一定角色。不過有意思的是本研究發現ICE陽性菌株對左氧氟沙星的耐藥率（14.8%）卻顯著性低于ICE陰性菌株（37.7%），P＜0.05，一個可能的解釋是：革蘭陽性球菌中，左氧氟沙星耐藥主要是由染色體DNA中喹諾酮耐藥決定區域（QRDR）上的點突變引起的，該耐藥性與ICE的關聯不大，本研究中ICE陽性菌株以ST-12型多見，而多個研究均發現ST-19型無乳鏈球菌通常表現為左氧氟沙星的高耐藥率，而其他ST型菌株的耐藥率較低[12-13]，其原因尚需進一步研究。

綜上所述，ICE在臨床分離的無乳鏈球菌中具有較高的檢出率，其可能在紅霉素、四環素等耐藥基因的水平傳播上起著一定作用，ICE陽性菌株中的主要克隆型為ST-12型。