新疆地區鮑曼不動桿菌多重耐藥菌株同源性分析

李 娟， 姚新寶， 郭淑麗， 楊麗瑋， 羅 斌， 王昌敏， 馬慧霞， 西麗娜依·買買提

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）屬不發酵糖革蘭陰性桿菌，是引起醫院感染的重要條件致病菌之一。近年來，由鮑曼不動桿菌引起的醫院感染逐年增加，尤其是重癥監護室（ICU）內的感染更嚴重[1-2]。鑒于新疆地域廣闊，僅烏魯木齊市臨床標本無法反映全疆多重耐藥鮑曼不動桿菌克隆傳播趨勢。本項研究收集新疆9地（州）醫院ICU多重耐藥鮑曼不動桿菌72株，針對其耐藥性及同源性進行分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集全疆9地（州）2016年5月－2017年10月72株多重耐藥鮑曼不動菌，剔除同一患者相同部位的重復菌株。其中，烏魯木齊38株、吐魯番4株、伊犁3株、石河子2株、昌吉7株、庫爾勒4株、阿克蘇5株、喀什3株、和田6株。菌株全部來源于住院患者：ICU 30株、外科ICU（SICU）18株、呼吸ICU（RICU）8株、燒傷創面修復科9株、呼吸科5株、神經外科ICU（NSICU）2株。分離自痰液40株、血液11株、傷口分泌物11株、靜脈導管尖端6株、氣管抽吸物4株，所有收集菌株經VITEK 2-Compact系統初步鑒定為鮑曼不動桿菌復合群后，嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》[3]第4版鑒定到種，置-80 ℃低溫冰箱保 存。

1.1.2 試劑和耗材 生化試驗管（購自杭州微生物試劑有限公司）、MO BIO UltraCleanTM微生物DNA 提取試劑盒、DiversiLab 不動桿菌試劑盒、DiversiLab 微流體芯片試劑盒和DNA 芯片（ 法國生物梅里埃公司）、 DNA聚合酶（N8080160，購自Thermo Fisher公司）、GN革蘭陰性桿菌鑒定卡片、革蘭陰性藥敏卡片（ 法國生物梅里埃公 司）為主要試劑耗材。

1.1.3 儀器 VITEK 2-Compact 微生物鑒定藥敏分析系統、VITEK MS全自動快速微生物鑒定質譜儀（ 法國生物梅里埃公司）、Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent Technologies 公司）、振蕩器（Vortex Genie 2 Vortex）、ABI 2720Thermal Cycler PCR儀、可見分光光度計（NanoDrop ND-1000）為主要實驗儀器。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用VITEK 2-Compact 系統藥敏卡（GN09），藥敏卡如無該抗菌藥物即采用紙片擴散法（頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、多黏菌素B、替加環素、米諾環素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、左氧氟沙星、氨芐西林-舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、環丙沙星、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦）。藥敏試驗采用2016年CLSI推薦的標準執行。質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603購自上海漢尼生物技術有限公司。每周用大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC Ultra 27853標準菌株作藥敏質控。

1.2.2 DiversiLab系統分型方法 DNA提取：在血平皿上挑取單個菌落使用MO BIO UltraCleanTMMicrobial DNA提取試劑盒提取細菌DNA。經分光光度計NanoDrop 1000檢測DNA濃度，使用蒸餾水調整DNA的濃度為25～50 mg/L。

1.2.3 目標片段擴增 使用DiversiLab不動桿菌DNA指紋圖譜試劑盒，配制25 μL PCR擴增體系；使用2720 PCR儀擴增，預變性94?℃ 2 min，94?℃變性30 s，50?℃退火30 s，70?℃延伸90 s為1個擴增循環，共擴增35個循環；最后70?℃延伸3 min。

1.2.4 PCR擴增產物的檢測 將擴增產物與凝膠按照順序注入含微流控芯片LabChips，使用Vortex Genie 2 振蕩器振蕩制備好的微流控芯片1 min，放入Agilent 2100生物分析儀對微流控芯片LabChips內的擴增產物片段進行檢測。

1.2.5 數據分析 通過獨立的、安全的DiversiLab互聯網分析軟件，擴增產物的結果按照分組實時分析DNA、指紋圖譜數據，在線生成報告。相似性系數無差異，條帶無差異，相似性系數97%以上表示來源于同一克隆；僅有1～2個條帶差異，相似性系數95%～97%，疑似暴發，表示有親緣關系；不同來源的3個或以上條帶差異，相似性系數95%以下，表示無親緣關系[4]。

2 結果

2.1 全疆鮑曼不動桿菌臨床資料

符合本研究多重耐藥鮑曼不動桿菌72株，臨床診斷以術后感染為主；標本采樣時間為2016年5月－2017年10月。其他地區菌株除和田2株分布在呼吸科外，其他菌株來源于重癥醫學科；臨床診斷以肺部感染為主；所有痰液標本經涂片均判定為合格標本。

2.2 藥敏試驗結果

72株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌均為多重耐藥菌，見表1。

2.3 全疆菌株同源性分析

根據擴增片段的多態性比較菌株間相似性。以95%作為標準可分為4型：1型為主要克隆，占59.7%；其次是3型，占16.7%；4型和2型分別為12.5%和11.1%。其中3型是烏魯木齊市獨有的克隆株；2型主要分布在烏魯木齊市、和田地區；而1型在全疆9個地區均有分布，其中烏魯木齊市占46.5%；4型主要分布于昌吉、和田地區，呈現特有的顯著條帶。1型相似性系數為95%～97%，而2、3、4型相似性系數均大于97%。通過列表，可以看出在新疆地區引起各種感染的鮑曼不動桿菌主要是1型克隆菌株。見表2。

表1 72株多重耐藥鮑曼不動桿菌對抗菌藥物耐藥率和敏感率Table 1 Susceptibility pro file of 72 multi-drug resistant Acetobacter baumannii strains（%）

表2 新疆地區72株臨床分離多重耐藥鮑曼不動桿菌的同源性和所致的感染性疾病Table 2 Homology among the 72 clinical strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from Xinjiang and the related infections

2.4 1型與3型克隆株耐藥性比較

鑒于1型克隆株為全疆流行株，而3型克隆株是烏魯木齊市獨有，比較其耐藥結果顯示：1型克隆株耐藥率稍低于3型，除替加環素2株耐藥，多黏菌素B 1株耐藥全部來源于3型克隆株，對其他抗菌藥物耐藥率的比較。見表3。

3 討論

鮑曼不動桿菌是近年來全球范圍內造成醫院感染流行的主要病原菌之一[5]，特別是耐碳青霉烯類菌株，給臨床治療帶來很大的困難。有文獻報道鮑曼不動桿菌具有較強的生物膜形成能力，當細菌以生物膜形式存在時，耐藥性及致病性明顯增強[6-7]。新疆自治區細菌耐藥監測網專家委員會數據分析，2016年鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥率為56.4%，而我院為75.5%，也高于2015年CHINET細菌耐藥性監測已接近70%的報道[8]。另外，住院時間延長以及使用昂貴的抗生素，多重耐藥菌所致醫源性感染發生率、病死率和醫療費用均明顯增高。

表2 （續）Table 2（continued）

表3 多重耐藥鮑曼不動桿菌1型與3型克隆株對抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility pro files of Clone 1 and Clone 3 multidrug resistant Acinetobacter baumannii strains（%）

表3 （續）Table 3（continued）（%）

本研究分別從全疆9地（州）醫院ICU收集符合要求的72株多重耐藥鮑曼不動桿菌，目的是了解各地區醫院耐藥克隆株分布情況，其研究結果能為全疆各級醫院院感管理監控部門進行監控提供重要的理論依據。諸多學者相繼報道各種基因分型方法優缺點[9-11]。本研究采用DiversiLab 系統，參照曲燕燕等[12]報道分析，該方法具有操作簡便、高通量和分型能力強等優勢。基于重復序列PCR引物與許多分布在整個基因組上特異性的重復序列配對；經過PCR擴增形成多個不同長短的片段，這些擴增的片段根據其質量差異，經電泳分析，得到由多條帶組成、強弱不一、專一性的重復序列PCR DNA指紋圖譜。通過此方法對全疆多重耐藥鮑曼不動桿菌進行同源性研究，結果分為4個不同的克隆型：①1型基因型在全疆9地（州）檢測到同一來源的多重耐藥鮑曼不動桿菌43株，各地區均有分布。實驗結果顯示：分布于烏魯木齊20株、阿克蘇5株、吐魯番4株、喀什3株、庫爾勒4株、石河子2株、伊犁3株、和田和昌吉各1株，說明在全疆不同地區、醫院、病房或同一地區、醫院、病房中發生多重耐藥鮑曼不動桿菌的播散。是否因碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的克隆傳播還有待進一步研究。 ②3型為烏魯木齊獨有克隆株，臨床資料顯示2017年8月從SICU不同燒傷患者送檢血液、分泌物、痰液標本中同時培養出多重耐藥鮑曼不動桿菌5株；同一時間段又從SICU另1例患者引流液標本中分離1株多重耐藥鮑曼不動桿菌，該患者臨床診斷椎管狹窄； 8月底9月初燒傷患者全部轉入燒傷創面修復科，從送檢靜脈導管尖端、分泌物、痰液標本培養出與SICU相同耐藥菌；同時從該科室電擊傷患者送檢的分泌物標本，也同樣培養出與SICU相同耐藥菌，根據擴增片段的多態性比較菌株間相似性，相似性系數在95%～100%，提示檢測到同一來源多重耐藥鮑曼不動桿菌；說明該克隆株在SICU有交叉傳播、SICU與燒傷創面修復科病房有交叉傳播。其中有1株克隆株來源于和田地區醫院ICU，可能與患者轉院有關。③ 2型基因型出現在烏魯木齊和和田地區，此群特點在不同ICU（RICU、SICU、NSICU）患者標本中分離出6株相同基因型，并且3個ICU分布在醫院不同區域和樓層，其次ICU不陪護，醫護人員出入病房也做好個人防護，但患者有轉科情況，導致傳播的主要因素與環境污染、手衛生有著密切關系，與劉延媛等[13]報道一致。同時發現SICU存在不同菌株，提示可能發生不同克隆株在醫院的交叉感染。和田有2株菌，分離自呼吸科病房，屬同一基因型，提示烏魯木齊與和田也具有同源性。④4型基因型分布于昌吉、和田地區，呈現特有的顯著條帶；通過臨床資料分析： 2016年8月10日分離自呼吸科病房，標本為痰液，臨床診斷肺部感染；同年8月23日分離自ICU，標本為痰液，臨床診斷慢性支氣管炎急性發作；同年9月6日分離自呼吸科病房，標本為痰液，臨床診斷肺氣腫，以上3株耐藥鮑曼不動桿菌來自和田醫院，相似性系數達99%，說明來源同一克隆菌株，存在于前例感染患者出院20 d后，在ICU的患者標本中及出院1個月后，仍然在同一科室患者標本中檢出具有同源性的多重耐藥鮑曼不動桿菌，提示病房環境衛生消毒不徹底，未能完全殺滅多重耐藥鮑曼不動桿菌；此克隆株為和田地區流行株。昌吉地區共有6株菌，屬4型克隆株，全部菌株來自ICU，入院與出院患者之間相差4～5個月，標本為痰液，臨床診斷重癥肺炎、肺部感染；提示ICU患者之間有交叉感染，表明昌吉與和田地區具有同源性，也是昌吉地區的主要流行株。同時比較1型與3型克隆株耐藥率，3型略高于1型。

綜上所述，分析全疆克隆株流行特點，各地（州）醫院要高度重視，特別是對需要轉院、轉科時，進行病房環境中鮑曼不動桿菌的監測；切斷多重耐藥鮑曼不動桿菌在全疆地區之間、醫院之間、科室之間、病房內的擴散傳播及散在傳播，防止交叉感染。