木姜葉柯茶樣品中總酚含量測定研究

敖紹林，宋成建，周賢平，裴正飛，高 陽，周福才，張亞州*

(1.貴州理工學院，貴州 貴陽 550031；2.廣西苷亮健生物技術有限公司，廣西 南寧 530001)

0 引言

木姜葉柯為殼斗科柯屬植物Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun.屬常綠喬木，別名甜茶(通稱)、甜葉子樹(云南)、胖稠(廣東)、甜味菜、大葉稠子、甘茶(貴州)、多穗石柯等，其以野生狀態分布于我國長江以南各省區海拔500～2 500 m的低山密林中，印度、泰國也有分布[1]。現代研究表明，木姜葉柯中的黃酮類成分主要是根皮苷與三葉苷，屬于二氫查爾酮類，它們具有降血糖，降血壓，降脂及抗過敏，抗炎等作用，尤其根皮苷在糖尿病及其并發癥的防治中具有獨特的效果[2-5]。但是木姜葉柯中另外一類主要化學成分為多酚類，具有抗氧化和清除自由基功能活性物質，還有抗腫瘤、抑菌、抗病毒、抗心腦血管疾病等活性，已被廣泛應用于醫療和保健行業，具有極大的利用前景[6]。

木姜葉柯甜茶在2017年6月獲得了國家衛計委新食品原料批復，在民間多使用其娕葉經加工而成的代茶飲。本研究擬通過對收集的主要產區的木姜葉柯的各種茶葉及原植物共12份樣品，采用Folin-Ciocalteu比色法測定樣品中的總酚含量，以明確不同產地、不同來源的木姜葉柯茶葉及原植物中多酚情況的了解。

1 試劑、試藥與儀器

木姜葉柯樣品為廣西苷亮健生物技術公司供應或通過購買獲得(詳細情況見下表1中內容)，所有樣品均由貴陽中醫學院董立莎教授鑒定為木姜葉柯植物來源；沒食子酸對照品(購于中國藥品生物制品檢定所)，無水碳酸鈉(分析純，秦皇島市化學試劑廠)，鎢酸鈉(分析純，天津市大茂化學試劑廠)，鉬酸鈉(分析純，天津市化學試劑四廠)，硫酸鋰(分析純，重慶東方試劑廠)；乙腈(HPLC級，成都科龍試劑有限公司)；甲醇(HPLC級，成都科龍試劑有限公司)；磷酸(分析純，北京化工廠)；水為娃哈哈純凈水。TU-1901紫外可見分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司)；BSA124S分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；KQ-300DB型數控超聲波清洗儀(昆山 市超聲儀器有限公司)。

表1 收集的木姜葉柯原植物部位及茶的樣品

2 方法與結果[7-8]

2.1 磷鉬鎢酸試液的配制

取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸 100 mL、磷酸 50 mL，加熱回流10 hr，放冷后現加硫酸鋰 150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)，冷卻，加水稀釋至1 000 mL，濾過，即得。

2.2 對照溶液的配制

精密稱取沒食子酸對照品25.2 mg，置25 mL的棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置100 mL的棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得(每mL中含沒食子酸0.0504 mg)

2.3 供試品溶液的配制

精密稱取樣品約100 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水適量，放置 30 min，振搖，超聲處理30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 總酚測定

精密量取供試品溶液1 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液 1 mL，再分別加水11 mL，用29%的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘(以相應的試劑為空白)，照紫外—可見分光光度法在760 nm的波長處測定吸光度。

2.5 方法學考察

2.5.1 標準曲線的制備

精密量取對照品溶液 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置 25 mL 的棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1 mL，再分別加水 11.5 mL、11 mL、10 mL、9.0 mL、8 mL、7 mL，用29%的碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30分鐘(以相應的試劑為空白)，照紫外—可見分光光度法在760 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

標準曲線的繪制：分別以在760 nm的波長下測定的吸收值A，以溶液濃度C(μg)對吸收值A進行線形回歸，得線形回歸方程：C=270.877 A-8.307；r=0.9995；線形范圍：25.2～201.6 μg 時線性關系良好。見下表2：

表2 沒食子酸線性關系考察(n=3)

2.5.2 精密度試驗

取溶液，精密吸取上配同一對照品溶液(濃度50.4 μg·mL-1)2 mL，置 25 mL 棕色量瓶中，照標準曲線的制備項下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1 mL”起，加水9 mL，重復6次測定吸光度(以相應的試劑操作為空白)，即得。結果吸光度值RSD為0.15%，精密度良好。見下表3：

表3 精密度試驗數據(n=6)

2.6 重復性研究

精密稱取樣品11粉末約100 mg，平行3份，加水適量，放置30 min，振搖，超聲處理30分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。依法測定吸光度A，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，即得。結果總多酚含量測定方法重復性試驗表明RSD為0.56%，(n=3)，樣品重復性良好。見下表4：

表4 總多酚含量測定的重復性試驗(n=3)

2.7 穩定性研究

精密吸取同一重復性試驗的供試品(樣品11)溶液，分別在不同時間(0，1，2，4 hr)測定，結果表明，樣品總生物堿測定在2小時基本保持穩定，所以樣品配制后最好在2 hr內測定結果較好。見下表5：

表5 總多酚含量測定的穩定性試驗(n=3)

2.8 加樣回收率試驗

分別精密稱取上面重復性試驗樣品11(樣品中總多酚含量9.095%)9份各50 mg，精密加入其樣品總多酚含量的75%、100%、125%的沒食子酸對照品溶液(精密稱取沒食子酸對照50.2 mg至50 mL量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。濃度 1.004 mg·mL-1)加水適量，放置30 min，振搖，超聲處理30 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。測定吸光度A，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，即得。結果表明，本總多酚含量測定方法的加樣平均回收率102.23%，RSD為0.77%，回收率良好。

表6 總多酚加樣回收率考察試驗數據(n=9)

2.9 樣品中多酚含量測定結果

方法同上，樣品測定中處理方法，測定吸光度A，從標準曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，即得。結果見表11。

表7 藥材樣品中總多酚含量測定結果(n=2)

結果如表7所示，通過本試驗方法測定發現收集的嫩葉中總酚含量最高，多酚含量為11.414%；其次為其它以嫩葉為原料加工的代茶制品，含量最低的為枝條，多酚含量為1.806%。

3 結語

目前對木姜葉柯葉中主要成份的研究主要集中根皮苷、三葉苷和根皮素等二氫查爾酮類成分，由于它們的含量較高，一般認為它們為主要功效物質。多酚類成分在木姜葉柯植物及茶葉加工品中往往被忽略，另外由于多酚類成分化學成分較復雜，也導致了對它們的相關研究較少。

本研究中選用的Folin-Ciocalteu比色法進行總酚測定時，放置時間不能太長，進行顯色后應盡量在2小時內進行樣品的測定；對樣品的處理溶劑中發現，甲醇、乙醇容易使總酚成分含量偏低而影響含量的測定結果，所以最后確定提取溶劑選用水較合適。

本次研究就主要針對對收集于不同產地，不同部位的原植物及加工制品進行其總酚含量測定?？偡訙y定本實驗采用了傳統的Folin-Ciocalteu比色法，最后確定收集到的12份木姜葉柯樣品中總酚的含量差異較大，范圍從1.806%到11.414%之間，而其中木姜葉柯枝干樣品中總酚遠遠的低于廣西南陽鄉木姜葉柯嫩葉樣品中含量，老葉中的總酚含量也低于一般其它的以嫩葉為原料的制成品。