復合果蔬汁促進植物乳桿菌在牛奶中增殖研究

文/何建新 江遠智 王順余 李 淵 陸圓圓 張 灝 杭 鋒＊

（1 浙江李子園食品股份有限公司；2 江南大學食品學院）

益生菌作為活的生物體[1，2]被應用于各種食品中，可以提高食品本身的價值和抗腐敗能力，改善人體腸道微生物菌群，調節免疫原性反應[3]，如谷物豆類發酵食品[4]、功能性寡糖[5]和發酵酸奶。牛奶是重要的益生菌載體[6]，因為牛奶含有豐富的蛋白質、維生素、碳水化合物，可以為微生物提供豐富的碳源、氮源和一些微量元素，滿足大多數微生物的生長，還可以使微生物長時間存活，基本滿足世界上絕大部分人對益生菌的需求[7]。

隨著經濟的發展，食品的發展不僅要求營養，而且還需要具備一定的功能[8]，因此，更多的益生菌被應用到食品研發中。植物乳桿菌是人體腸道的常見微生物，除了少數幾株菌對酸和膽鹽比較敏感外，植物乳桿菌皆具有較強的耐酸和耐膽鹽能力[9，10]，可以與致病菌（如大腸桿菌）競爭[11]，降低致病菌在人體腸道的生長和繁殖能力，降低膽固醇水平[12]，具有吸附重金屬的作用[13]，同時，植物乳桿菌可以粘附在腸道黏膜表面[14]，作為活的生物體起作用。因此，以牛奶為載體，讓植物乳桿菌在其中生長，既可以作為牛奶的發酵劑，也能將植物乳桿菌的功能植入到牛奶中，還可以保持單位體積的高活菌數，而且容易被人們所接受。

植物乳桿菌屬于營養缺陷型細菌，自身不能合成多種氨基酸和嘌呤[15]，同時，植物乳桿菌缺乏胞外蛋白酶基因[16]，不能合成蛋白質水解酶[17]，不能有效將牛奶中的乳蛋白分解成多肽和氨基酸而用于植物乳桿菌的生長和繁殖。因此，僅靠牛奶中的營養成分不能滿足植物乳桿菌的代謝和繁殖，導致牛奶難以凝乳和單位毫升內活菌數難以提高，需要尋找可以促進植物乳桿菌在牛奶中生長的增殖劑，使得植物乳桿菌可以在牛奶中快速增殖。果蔬汁中含豐富的氨基酸、維生素和生物活性物質，不僅能夠促進植物乳桿菌的生長[18]，還可以作為植物乳桿菌的載體[19]，同時，植物乳桿菌CCFM 8661是從泡菜中分離得到的，因此，果蔬汁中含有植物乳桿菌生長和繁殖所需的營養物質。

1 材料與方法

1.1 菌種

植物乳桿菌CCFM 8661，江南大學于2007年從中國傳統發酵泡菜中分離獲得，菌種保藏編號為CGMCC NO.5494，菌粉由江蘇省微康生物科技有限公司生產（活菌數為3.8×1011CFU/g）；YO-MIX M11商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌），杜邦丹尼斯克公司生產。

1.2 材料與試劑

材料：菠蘿、黃瓜、獼猴桃、豆漿、玉米、番茄、胡蘿卜（揚州廣陵區大潤發超市）；天然乳清（上海仟爵生物科技有限公司）；低脂果膠（上海藍安實業有限公司）；玉米淀粉NOVATION 2300（宜安瑞中國有限公司）；蔗糖［一級，上海糖業煙酒（集團）有限公司］；香蕉漿（DOHLER）；全脂奶粉（徐州凱舜乳業有限公司）。

試劑：酚酞（98%，博飛美科）；瓊脂粉、魚粉蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏，均為生化試劑，氫氧化鈉、無水磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、無水乙酸鈉、葡萄糖、無水乙醇、氯化鈉、七水硫酸鎂、一水硫酸錳、L（+）-抗壞血酸，均為分析純，吐溫80，化學純（國藥集團化學試劑有限公司）；甘油磷酸鈉、胰蛋白胨（生工生物工程股份有限公司）；大豆蛋白胨（博試生有限公司）。

1.3 儀器與設備

堿式滴定管；培養箱BSP-150（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；超純水機VE-60CH-AI（深圳市宏森環保科技有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-70A（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；超凈臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；實驗室pH計ST3100［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；榨汁機HS-200（中山市海尚電器有限公司）。

1.4 酸奶制作流程

1.4.1 原料前處理

將菠蘿、黃瓜、獼猴桃、玉米、番茄、胡蘿卜用清水洗凈，榨汁機打漿，4 層紗布過濾，收集濾液即為果蔬汁增殖劑。菠蘿汁、黃瓜汁、獼猴桃汁均在95 ℃條件下滅酶15 min，-40 ℃貯存備用。復合果蔬汁的組合原則是較高pH值和較低pH值的果蔬汁進行混合，牛奶初始pH值低會影響其穩定性。復合果蔬汁分別為黃瓜汁-獼猴桃汁（1∶1）、菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）、豆漿汁-玉米汁（1∶1）、番茄汁-胡蘿卜汁（1∶1），pH值分別為4.24、4.25、5.60、4.70，添加量為7.5%，添加復合果蔬汁后的牛奶pH值分別為6.52、6.36、6.57、6.54。

1.4.2 發酵乳工藝

將90 g奶粉與500 g水混合，攪拌均勻，置于4 ℃冰箱中；將70 g糖溶解在260 g水中，常溫下加入1.5 g低脂果膠和2 g天然乳清，攪拌均勻，然后將兩者加熱至55 ℃后互混，繼續攪拌均勻，加入自來水使總質量為1 000 g，即為發酵乳基料。向發酵乳基料中緩慢添加4 種復合果蔬汁，添加量為7.5%；同時，為了進一步考察香蕉漿和菠蘿汁對植物乳桿菌CCFM 8661的增殖作用，分別單獨添加香蕉漿和菠蘿汁，添加量分別為5%、7.5%、10%，上述即為含果蔬汁的發酵乳基料。

將60 g發酵乳基料和含果蔬汁的發酵乳基料置于100 mL奶瓶中，放入滅菌鍋內，108 ℃條件下滅菌15 min，滅菌結束后冷卻至室溫，接種發酵劑，其中植物乳桿菌CCFM8661的接種量為2.5×107CFU/mL，商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）的接種量為6.0×106CFU/mL。添加果蔬汁的發酵乳基料接種植物乳桿菌CCFM8661，發酵乳基料接種植物乳桿菌CCFM8661作為空白對照，接種商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）和植物乳桿菌CCFM8661進行協同發酵試驗。

1.5 檢測方法

協同發酵試驗在發酵0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h時取樣，其余試驗在發酵0 h、24 h、48 h時取樣。

發酵乳樣品的pH值使用pH計直接測定；滴定酸度參照《食品安全國家標準 食品酸度的測定》（GB 5009.239-2016）；活菌數采用稀釋梯度平板計數法，超凈臺上用無菌移液槍取5 mL樣品于滅菌的牛奶瓶中，加入45 mL生理鹽水，依次稀釋10 倍，一直稀釋到10-7梯度，取稀釋梯度10-5、10-6、10-7各1 mL于培養皿中，其中以植物乳桿菌CCFM8661作為發酵劑的樣品使用MRS培養基計數，以商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）和植物乳桿菌CCFM8661共同作為發酵劑的樣品分別使用M17培養基和MRS培養基計數。

圖1 溫度對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

圖2 空白對照組和添加4 種復合果蔬汁樣品組發酵過程的pH值變化

2 結果分析

2.1 溫度對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

為研究不同溫度條件下植物乳桿菌CCFM8661的增殖情況，在32℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃條件下發酵24 h，測定空白對照組和添加4 種復合果蔬汁樣品組的活菌數，結果見圖1。在不添加4 種復合果蔬汁情況下，發酵24 h時，活菌數未發生明顯增加，總體差異不大。在添加4 種復合果蔬汁情況下，菠蘿汁-香蕉漿樣品組促進增殖作用最好，32 ℃、35 ℃、37 ℃、40℃條件下發酵24 h后的活菌數分別為4.7×108CFU/mL、1.4×109CFU/mL、1.21×109CFU/mL、5.7×108CFU/mL，說明植物乳桿菌CCFM8661在32 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃均可生長，35 ℃、37℃比32 ℃、40 ℃更利于植物乳桿菌CCFM8661的生長，35 ℃為最適生長溫度。

2.2 滴定酸度和pH值

由圖3可知，滴定酸度與活菌數變化基本一致，菠蘿汁-香蕉漿樣品組在發酵24 h時的滴定酸度和活菌數最高，分別為100°T和1.4×109CFU/mL；發酵24 h后，植物乳桿菌CCFM8661的生長進入穩定期，后續發酵對活菌數影響不大，滴定酸度的增加也不顯著，發酵48 h時滴定酸度為111°T，僅上升了11°T。

酸是植物乳桿菌的代謝產物，發酵乳的滴定酸度和pH值可以作為活菌數的表征，也可以作為發酵乳的理化參數，空白對照組和添加4種復合果蔬汁樣品組發酵過程的pH值變化如圖2所示，滴定酸度和活菌數變化見圖3。

由圖2可知，發酵時間越長，pH值越低；發酵24 h時，樣品組的pH值比空白對照組低，pH最低的是菠蘿汁-香蕉漿樣品組，為3.8，pH最高的是番茄汁-胡蘿卜汁樣品組，為5.35；發酵24 h后，菠蘿汁-香蕉漿樣品組繼續發酵的pH值下降不明顯，至48 h時pH值僅下降0.03。

2.3 復合果蔬汁對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

發酵溫度為35 ℃，空白對照組和添加4 種復合果蔬汁樣品組在0 h、24 h、48 h時的活菌數見圖4。植物乳桿菌CCFM8661接種量為2.5×107CFU/mL，發酵24 h后，空白對照組的活菌數依然無法達到1.0×108CFU/mL；樣品組發酵24 h后的活菌數全部可以達到1.0×108CFU/mL，促進生長作用最好的是菠蘿汁-香蕉漿樣品組，活菌數最高可以達到1.4×109CFU/mL，促進生長作用最差的是番茄汁-胡蘿卜汁樣品組，活菌數僅能達到1.49×108CFU/mL；發酵24 h后，后續發酵并沒有使活菌數上升，說明24 h后的發酵液不適合植物乳桿菌CCFM8661繼續增殖，可以將24 h作為發酵終點。

圖3 空白對照組和添加4 種復合果蔬汁樣品組發酵過程的滴定酸度和活菌數變化

圖4 復合果蔬汁對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

2.4 菠蘿汁和香蕉漿對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

菠蘿汁、香蕉漿、菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）樣品組在35 ℃條件下發酵0 h、24 h、48 h后的酸度和活菌數見圖5。單獨添加香蕉漿對促進植物乳桿菌CCFM8661增殖的效果不好，最高活菌數僅能到達1.39×108CFU/mL，最高滴定酸度為55 °T，發酵乳未發生凝乳；單獨添加菠蘿汁對促進植物乳桿菌CCFM8661增殖的效果很好，添加量越大，活菌數和滴定酸度越高，在發酵24 h時，菠蘿汁添加量為5%、7.5%、10%樣品組的活菌數分別為1.54×109CFU/mL、1.69×109CFU/mL、1.85×109CFU/mL，滴定酸度分別為110°T、112°T、127°T。將5%菠蘿汁添加到牛奶中，108 ℃滅菌15 min后，出現水相層，且添加量越高，水相層越厚。分別添加5%香蕉漿和5%菠蘿汁的發酵乳基料的初始pH值為6.54和6.28，說明初始pH值低會影響體系穩定性，加入香蕉漿可以改善體系的初始pH值，添加量為7.5%的菠蘿汁-香蕉漿體系穩定性相對較好。

2.5 協同發酵試驗

植物乳桿菌缺乏蛋白質水解酶，不能水解牛奶中的乳蛋白，因此牛奶不能滿足植物乳桿菌對生長和繁殖的營養需求。商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）可以水解牛奶中的乳蛋白[20]，本文將植物乳桿菌CCFM8661和商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）同時接種到牛奶中，探究植物乳桿菌CCFM8661能否利用商業酸奶發酵劑的代謝產物增殖。空白對照組和協同發酵樣品組在35 ℃條件下發酵0 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h后的滴定酸度與活菌數見圖6，協同發酵樣品組和菠蘿汁-香蕉漿樣品組在35 ℃條件下發酵0 h、24 h、48 h后的活菌數見圖7。

由圖6可知，協同發酵使植物乳桿菌CCFM8661在發酵液中的活菌數明顯升高，發酵24 h時的活菌數可達到3.3×108CFU/mL，比植物乳桿菌CCFM8661單獨發酵效果好；前6 h的發酵過程中，植物乳桿菌CCFM8661生長緩慢，活菌數只有9.5×107CFU/mL，但總活菌數達到5.4×108CFU/mL，商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）生長迅速；6 h后的發酵過程中，總活菌數的增加以植物乳桿菌CCFM8661為主，發酵48 h時，植物乳桿菌CCFM8661活菌數達到4.2×108CFU/mL，說明商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）的代謝產物可以被植物乳桿菌CCFM8661利用，可能是商業酸奶發酵劑（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）將乳蛋白分解成多肽和氨基酸，進而被植物乳桿菌CCFM8661利用。

圖5 菠蘿汁和香蕉漿對植物乳桿菌CCFM8661增殖的影響

由圖7可知，協同發酵可以使植物乳桿菌CCFM8661在牛奶中增殖，但促進作用不如添加復合菠蘿汁-香蕉漿好。添加復合菠蘿汁-香蕉漿可以使牛奶中的植物乳桿菌CCFM8661活菌數上升2 個數量級，而協同發酵只能使牛奶中植物乳桿菌CCFM8661活菌數升高1 個數量級，但協同發酵總活菌數可以達到9.8×108CFU/mL，也可以作為新型酸奶的發酵劑。

3 討論與分析

植物乳桿菌屬于乳酸菌屬，產酸能力比較強，而且具有較強耐酸、耐膽鹽能力[9，10]，黏附在腸道黏膜表面的能力較強[14]，人體腸道植物乳桿菌增多，則腸道表面黏附致病菌減少，不能黏附在腸道表面的致病菌會隨著糞便排出，降低了致病菌在腸道中長時間停留的危害，因此，植物乳桿菌具有益生特性。

圖6 空白對照組和協同發酵樣品組發酵過程的滴定酸度和活菌數

細菌在生長繁殖過程中不可避免地涉及到多種酶，酶在轉運和代謝過程中起著關鍵作用，如果酶的活性受到影響，將嚴重影響細菌的生長和代謝。溫度與酶的活性息息相關，在最適溫度條件下，酶的活性最高，合成細菌生長和繁殖的必需氨基酸、核苷酸、蛋白質的速度也最快，因此，活菌數最高。本文研究結果表明，35 ℃最適合植物乳桿菌CCFM8661的生長。

圖7 協同發酵樣品組和菠蘿汁-香蕉漿樣品組發酵過程的活菌數

國內外研究者通過添加氨基酸、核苷酸、礦物質、維生素和果蔬汁等增殖劑，促進植物乳桿菌在牛奶中增殖。Ma等[15]通過試驗證明了異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和核苷酸前體物質是植物乳桿菌在牛奶中增殖的必需成分。類芽孢桿菌BD3526發酵上清液[21]、酵母提取物、酪蛋白酶解物、蛋白胨[17]作為增殖劑，可以促進植物乳桿菌生長，而且可以使酸奶凝乳，說明植物乳桿菌利用乳蛋白能力較弱，通過添加被植物乳桿菌吸收利用的氮源，可以促進植物乳桿菌在牛奶中增殖。Yang等[18]研究表明，添加10%黑莓汁可以使植物乳桿菌在牛奶中的活菌數達到1×1010CFU/mL。本文試驗結果表明，果蔬汁含有可以被植物乳桿菌利用的氮源，能夠促進植物乳桿菌在牛奶中增殖，菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）效果最好。

一種菌的代謝產物可以作為另一種菌的原料，同時，多種菌同時作為發酵劑，可以產生更多的生物活性物質[22，23]，加強機體的免疫能力。通過協同發酵使植物乳桿菌在牛奶中生長也是一種比較廉價的方式，具有較大的商業價值[24]。本文試驗結果表明，協同發酵使植物乳桿菌CCFM8661活菌數升高了50倍，總活菌數比普通酸奶的活菌數要高，作為復合型酸奶的新品，也可以投入市場。

4 結論

通過空白對照組與添加果蔬汁樣品組的對比試驗，添加果蔬汁可以明顯改善植物乳桿菌CCFM8661在牛奶中的增殖，菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）效果最好，活菌數可達1.4×109CFU/mL，而且酸奶穩定性及風味比較好；菠蘿汁添加量高，則活菌數高，但體系穩定性不好；協同發酵可以使植物乳桿菌CCFM8661活菌數達到4.2×108CFU/mL，但總活菌數不高。因此，以菠蘿汁-香蕉漿（1∶1）作為植物乳桿菌CCFM8661在牛奶中的增殖劑，35 ℃條件下發酵24 h效果最佳。