人胎盤粉外敷對糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合的影響

趙富生，武庚★，張曉莉，張際緋，石學魁，劉志新，李玉婷，趙曉翔，戴安

（1.牡丹江醫學院，黑龍江 牡丹江 157000；2.西雙版納州人民醫院，云南 西雙版納 666100）

0 引言

糖尿病已成為嚴重威脅人類健康和生活質量的常見疾病。據統計，2015 年全球約有4.15 億人罹患糖尿病，預計到2040 年全世界糖尿病患者人數將達到6.42 億[1]。統計資料顯示，我國成年人糖尿病患病率高達11.6%，如據此推算，我國糖尿病患者人數達1.1 億，成為世界上糖尿病患者人數最多的國家[2,3]。糖尿病足是一種常見的糖尿病并發癥，由血糖代謝紊亂而引起的局部神經異常和下肢肢端血管病變，臨床表現為足部局部組織感染和潰瘍，是導致患者致殘和死亡的重要原因之一[4]。研究資料顯示，在我國糖尿病足約占門診糖尿病患者的2%，占住院糖尿病患者的12.4%[5]。目前，盡管中西醫綜合治療可緩解糖尿病足癥狀，但遠期療效并不明顯。人胎盤又稱紫河車，據《本草綱目》記載“紫河車味苦、咸、性溫”，具有“安神、補氣、益精、解毒、補氣之功效”。現代醫學研究表明，胎盤提取物具有防止粘連、減輕疼痛和促進上皮愈合的作用[6]。本研究通過觀察胎盤粉外敷對糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合的影響，旨在尋找治療糖尿病皮膚潰瘍的有效方法。

1 材料

1.1 動物

SPF 級1 月齡SD 大鼠30 只，雌雄不限，體質量90～120 g，自由食水，室溫(20±2)℃條件下普通飼料分籠喂養，晝夜12 h 交替光照。實驗動物由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（黑）2012-010，實驗過程中對動物的處置符合醫學倫理學標準。

1.2 藥物、試劑和儀器

紫河車膠囊（北京同仁堂健康藥業股份有限公司）；ICAM-1 兔抗大鼠單克隆抗體（Abcam 公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；ELISA 試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；體式顯微鏡（SMZ745 型，Nikon公司）；酶標儀（2013A70D，Thermo Fisher 公司）；高壓蒸汽消毒鍋（GYZ-2000 型，上海博訊實業公司）；電子分析天平（A2104 型，上海方瑞儀器廠）。

2 方法

2.1 建模及實驗分組

建模前大鼠禁食12h，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，60mg/kg）誘發糖尿病，注射3d 后，尾靜脈采血檢測隨機血糖水平，并觀察大鼠體重變化。大鼠空腹血糖＞16.7mmol/L 時，認為糖尿病模型制備成功[7]。本研究中20 只大鼠制備糖尿病模型，采用隨機數字表法將大鼠隨機分為模型組（B 組）和治療組（C 組），每組10 只大鼠。選取10 只正常大鼠為對照組（A 組）。

2.2 皮膚潰瘍制備及干預

用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉各組大鼠，常規消毒后，在大鼠脊柱腰背部兩側標記直徑為2.0cm 的圓形圖案，用手術剪沿著標記線剪去全層皮膚和皮下組織，止血后用無菌紗布包扎，次日起每日用50% 冰醋酸涂抹創面，制備皮膚缺損潰瘍模型。潰瘍形成后，A 組和B 組用生理鹽水清洗后包扎處理，每日1 次；C 組用生理鹽水清洗潰瘍后外敷胎盤粉包扎，每日處理1 次。

2.3 潰瘍創面愈合評價

潰瘍制備第0、2、4、6、8、10、12、14d 測量各組大鼠皮膚潰瘍面積。具體方法如下：將透明薄膜覆蓋在潰瘍表面，用記號筆將潰瘍輪廓勾畫在透明薄膜上，取下透明薄膜，測量最長和最短直徑后求平均值，計算潰瘍面積。

2.4 炎性細胞因子含量檢測

潰瘍制備第14d，乙醚麻醉后處死各組大鼠，切取潰瘍與正常皮膚交界處組織勻漿取上清液，根據ELISA 試劑盒的操作說明，測定各組大鼠潰瘍組織炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18的含量。

2.5 細胞間黏附分子-1 蛋白表達檢測

潰瘍制備第14d，麻醉處死各組大鼠，切取潰瘍與正常皮膚交界處組織，加入裂解液研磨，4℃、12000r/min 離心，取上清液，采用BCA 法測定蛋白含量。取適量上清液于沸水中煮5min 變性，經凝膠電泳后轉移至PVDF 膜上，置于5%脫脂奶粉溶液封閉2h，滴加TBST 稀釋的兔抗大鼠細胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1）一抗，4℃孵育過夜，次日TBST 漂洗PVDF膜3 次，滴加辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育2h，TBST 漂洗膜3 次，使用化學增強發光劑（ECL）顯影，凝膠成像，采用Quantity One 軟件分析目標蛋白條帶的灰度值。

2.6 統計學方法

采用SPSS 16.0 統計軟件對實驗數據進行統計學分析，數據均以mean±SD 表示。多組間比較采用單因素方差分析。兩組之間比較使用最小顯著性差異檢驗（LSD）。P＜0.05 認為具有統計學差異。

3 結果

3.1 大鼠皮膚潰瘍面積比較

腹腔注射STZ 后，模型組和治療組中大鼠進食和飲水量明顯增多，體重逐漸減輕，體質瘦弱，毛發呈黃色且無光澤。如圖1 所示，潰瘍制備第0 天，各組大鼠脊柱兩側創口規整，有少量滲出。潰瘍制備第14 天，對照組潰瘍縮小，可見新鮮肉芽組織，有鼠毛生長；模型組潰瘍愈合差，潰瘍邊緣可見瘢痕組織，幾乎看不到新鮮肉芽組織，有膿性滲出；治療組潰瘍縮小，潰瘍周邊可見少量肉芽組織及滲出物。不同時間點各組潰瘍面積比較如表1 所示，與對照組相比較，模型組和治療組中大鼠皮膚潰瘍面積較大（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組中大鼠皮膚潰瘍面積明顯縮小（P＜0.05），但仍大于對照組（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠皮膚潰瘍愈合情況

表1 不同時間點各組大鼠皮膚潰瘍面積比較

3.2 炎性細胞因子含量比較

各組炎性細胞因子含量如圖2 所示，與對照組相比較，模型組和治療組潰瘍組織炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-18 含量均明顯增高（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組潰瘍組織炎性細胞因子均顯著減低P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.05）。這些結果提示，胎盤粉外敷能夠降低潰瘍組織炎性細胞因子的含量，減輕潰瘍組織炎癥反應。

圖2 各組潰瘍組織炎性細胞因子含量比較

3.3 細胞間黏附分子-1 蛋白表達

各組潰瘍組織中ICAM-1 蛋白表達如圖3 所示，與對照組相比較，模型組和治療組ICAM-1 蛋白表達均明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比較，治療組ICAM-1 蛋白水平明顯增高（P＜0.05），但仍低于對照組（P＜0.05）。這些結果提示，胎盤粉外敷能夠促進潰瘍組織中ICAM-1 蛋白合成，促進潰瘍組織創面愈合。

圖3 各組潰瘍組織中ICAM-1 蛋白表達水平比較

4 討論

糖尿病皮膚潰瘍是由于糖代謝紊亂、神經病變、血液循環障礙以及感染等多種因素共同作用誘發的一種糖尿病并發癥。在臨床中，糖尿病皮膚潰瘍治療多根據原因進行針對性地治療,如清創換藥、紅外線短波局部照射治療等，但療效欠佳。在重度潰瘍治療過程中，因反復清創、換藥等操作,給患者帶來極大的痛苦，也給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔。因此，尋找一種有效的治療方法是目前臨床急需解決的重大問題。近年來，越來越多的研究表明，中醫藥對糖尿病皮膚潰瘍具有顯著療效。

現代醫學研究認為，胎盤提取物具有防止粘連、減輕疼痛和促進上皮愈合的作用[8-9]。此外，有研究表明，人胎盤組織中含有蛋白質、糖、鈣、維生素、免疫因子、促性腺激素等多種生物活性物質，具有抗感染、抑制尿激酶激活和免疫調節功效，能夠有效促進創傷愈合[10-11]。Kwon 等[12]研究發現，人胎盤提取物能夠調節成纖維細胞增殖、分化促進創口愈合。糖尿病皮膚潰瘍常常繼發于老年患者，病程長，創口愈合慢，反復發作，且多伴有營養不良等原發性疾病，臨床治療往往依賴于外科手術治療，極大地增加了手術風險。

本研究中，以糖尿病大鼠為研究對象制備慢性潰瘍模型，觀察胎盤粉外敷對潰瘍愈合的促進作用。研究發現，采用人胎盤粉外敷不僅能夠促進大鼠糖尿病皮膚潰瘍創面愈合，同時也可降低潰瘍組織中炎癥細胞因子的含量。IL-1β、IL-6、和IL-18 是白細胞介素家族成員，能夠促進多種炎癥細胞活化和浸潤，并介導炎癥的級聯放大效應。TNF-α 來源于單核巨噬細胞，具有促炎癥和導致組織炎性損傷的作用[13]。人胎盤粉中含有多種生物活性物質，具有抑制炎癥反應，加速創傷愈合的功能。因此，我們推測，胎盤粉外敷促進潰瘍愈合可能與這些生物活性物質的抗炎作用相關。

ICAM-1 屬于細胞表面糖蛋白家族成員，具有維持組織形態結構，調節內皮細胞間緊密連接以及加強細胞與基底膜之間黏附的作用，并參與白細胞和內皮細胞遷移過程。在機體免疫、細胞間信號轉導、細胞生長及分化、炎癥反應、毛細血管形成等過程中發揮重要的作用。研究表明，ICAM-1 通過與血管內皮細胞表面的特異性受體結合而發揮特定的生物學作用，如炎癥時ICAM-1 表達升高介導白細胞的活化，為白細胞跨越內皮游出提供了條件[14]。本研究中，人胎盤粉外敷能夠促進大鼠糖尿病皮膚潰瘍創面愈合，我們推測可能與胎盤粉促進潰瘍局部組織中ICAM-1 表達有關，但機制尚不清楚。

總之，應用人胎盤粉外敷能夠促進糖尿病潰瘍瘡面愈合，為糖尿病皮膚潰瘍治療提供了一種有效的方案，但具體治療機理還需要進一步深入研究。