篩選口腔扁平苔蘚相關相關基因及生物學通路的研究

隋長德 夏萍 齊春華

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus，OLP)是一種累及口腔黏膜且可反復發作的慢性炎癥疾病，患病率為0.51%，在口腔黏膜疾病中居第2 位，屬常見病[1]。OLP多見于中老年患者，其主要的病理改變是基底細胞液化變性及上皮下淋巴細胞浸潤。但是目前，OLP 的病因及發病機制仍不明確，有學者認為心理社會因素及免疫因素與其有明顯的聯系，特別是OLP患者自身免疫功能的改變可能在其發病過程中起到重要作用，如臨床上對于OLP患者選用免疫調節劑治療后，患者的癥狀可有所緩解。

OLP的發生發展可能也是由多個基因綜合作用而導致。因而對于OLP等病因尚未明確的疾病，越來越多的研究者將目標關注到識別其發病過程中的生物學通路上。生物信息學是現代生物學與醫學科學(如生物化學、細胞生物學、發育生物學、遺傳學、基因組學、生理學)和信息科學、計算機科學、生物統計學、數學等學科相互滲透并高度交叉形成的一門新興前沿學科[2]。生物信息學綜合運用數學、計算機科學和生物學工具，對高通量數據進行分析，進而達到理解這些數據中所蘊含的生物學含義。

用于篩選差異表達基因的基因芯片技術，具有高通量和快速測量等優點， 在疾病基因的發現、疾病分子水平診斷、及藥物篩選等許多領域起著巨大推進作用。該技術已經成功的被用于包括OLP在內的許多疾病發生發展的機制研究當中[3-4]。

借助于生物信息學方法對以往基因芯片所產生的高通量數據進行系統分析，對于識別OLP有關的生物學通路及關鍵分子將對認識、OLP的發病機制以及研究新的OLP診斷和治療方法顯得尤為重要。

1 材料及方法

1.1 基因表達譜數據分析

GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫是當前規模最大、收錄最全、免費開放的公共基因表達數據庫。本研究中的GSE38616取自于基因表達譜數據庫(GEO)[5]。該數據組織樣本取自與7 例OLP患者口腔黏膜及7例健康對照組口腔黏膜組織，利用芯片Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array (Affymetrix, Santa Clara, CA) 檢測了兩組之間的基因表達情況[4]。為了得到健康和疾病組中的差異表達基因，本研究利用BRB-ArrayTools v4.2.0[6]中的RMA(robust multi-array analysis)方法對該原始數據進行標準化和歸一化處理，用t檢驗結合Benjamini-Hochberg校正的方法[7]分析差異表達基因，P<0.01認為有統計學差異。

1.2 富集分析

通過富集分析軟件Toppgene[8]分析上述差異表達基因及模塊中基因所具有的生物學通路。Toppgene是一個在線的界面非常友好的基因集分析工具。在本研究中，僅僅關注于生物學通路及細胞生物學過程的分析。

1.3 蛋白質網絡構建

STRING 10.0數據庫[9]是一個常用的蛋白質-蛋白質互作數據庫, 數據庫。該數據庫中的相互作用包括了蛋白質之間直接的相互作用，也包括蛋白質間接功能的相關性。互作數據庫中的每個點代表一個蛋白質，每條邊代表相連的兩個蛋白質具有互作關系。該互作關系來自實驗數據、文本挖掘、數據庫以及生物信息學預測的數據。將上述得到的差異表達基因映射到該數據庫中，進而研究上述基因所編碼的蛋白質之間的相互作用，以進一步理解這些差異表達基因的具體作用功能。其中，為了使OLP相關蛋白質互作網絡更接近于現實的功能狀態，只保留交互作用評分大于0.4的節點。

1.4 Hub節點分析

Cytoscape[10]是一個免費開源軟件，該軟件通過其附帶的很多插件可以對蛋白質互作網絡進行分析并可視化。通過Cytoscape中插件CentiScape[11]對OLP疾病網絡拓撲結構進行分析，并挖掘其中的Hub節點。Hub節點一般是網絡中度、介數等最多的節點，也就是疾病網絡中處于中心位置的節點，與其他蛋白質互作最多的節點，因而其可能在疾病過程中起到關鍵作用。

1.5 Hub基因在全身的表達

為了進一步明確該上述篩選出來的Hub基因在正常口腔黏膜及全身的表達情況，我們采用Human eFP Browser 對該基因的表達情況進行分析。

1.6 GNB2L1在OLP患者外周血中的表達

由于GNB2L1基因又名人蛋白激酶C受體1(activated protein kinase C1 (RACK1)。采用熒光定量RT-PCR對口腔扁平苔蘚患者及健康對照組血清中RACK1的表達進行檢測。收集2015～2016 年就診于哈爾濱醫科大學附屬第二醫院口腔科的口腔扁平苔癬患者20 例(男6 例，女14 例)，健康體檢者20 例(男5 例， 女15 例)。 2 組間性別及年齡差異無統計學意義(P>0.05)。所有參與者均知情同意并有良好的依從性,并且排除其他系統疾病，所有參與者在近1個月未使用過抗生素等免疫藥物治療。采集患者及健康對照者晨起空腹外周靜脈血5 ml，加入EDTA 抗凝后，按照全血RNA提取試劑盒(美國Omega 公司)提取試劑盒說明從樣本中提取總RNA。采用日本Takara逆轉錄-熒光定量試劑盒合成cDNA及RT-PCR定量分析。反應體系為25 μl。RACK1引物上游為CACATTGGCCACACAGGCTATC,下游TGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGA。 β-actin引物上游為TGAAGATCAAGATCATTGCTCCTC，下游為 CACATCTGCTGGAAGGTGGAC。反應條件為： 95 ℃預變性，30 s， 95 ℃15 s， 60 ℃ 15 s， 72 ℃ 30 s(40 個循環)。數據分析采用2-ΔΔCT方法計算扁平苔蘚組相對于對照組的表達差異倍數。結果Graph pad Prism 3.0 中的t檢驗進行分析，檢驗水準為α=0.05。

2 結 果

2.1 差異表達基因及富集分析

對GSE38616進行分析后，P<0.05的差異基因有212 個，其中上調45 個， 下調167 個。通過富集分析顯示這些差異表達基因中212 個差異表達基因共富集有29 個生物學通路。排在前10的生物學通路有：G蛋白偶聯受體信號通路(Signaling by GPCR)、嗅覺信號通路(Olfactory Signaling Pathway)等(表1, 圖1)。 所富集的細胞生物學過程有：信號轉導(Signal transduction)、免疫反應(Immune response)、細胞通訊(Cell communication)，類固醇代謝(Steroid metabolism)、突觸小泡轉運(Synaptic vesicle transport)等。

2.2 蛋白質互作網絡構建及中心節點分析

通過蛋白質數據庫STRING10.0，將OLP相關的212 個差異表達基因映射到PPI中之后，即構建OLP相關蛋白質互作網絡(圖1)。通過Cytoscape中插件CentiScape對網絡分析之后，發現其Hub節點為RACK1(圖2)。

采用Human eFP Browser[12]，發現與全身其他組織相比，Hub基因RACK1在口腔黏膜、舌組織中的表達最高(圖3)。進一步提示該基因在口腔黏膜、舌組織中的有著重要作用。

2.3 RACK1在OLP及健康對照組外周血中的表達

結果顯示RACK1 mRNA 相對表達量在OLP外周血中的表達顯著高于正常對照組，大約上調了近一倍(圖4，t=9.21，P<0.001)。

表1 212 個差異表達基因富集的通路(前十個)

圖1 差異表達基因富集的生物學通路及生物學過程

3 討 論

復雜疾病往往涉及復雜的生物學通路異常，而這些通路則依賴于復雜的基因或蛋白質互作網絡。通過此網絡進行研究，可以發現疾病過程中特定的細胞相互作用，還可以從系統水平上識別疾病相關基因及疾病相關生物學通路[13]。

在過去的幾年中許多研究者通過高通量的方法，如基因芯片技術，檢測了OLP患者相對于健康對照組的基因表達情況，得到了成百個差異表達基因與OLP相關。本研究采用生物信息學方法，成功篩選出212 個OLP相關的差異表達的個基因，為該疾病的進一步實驗室研究提供了線索及基礎。

對上述差異表達基因進行富集分析，從系統水平尋找與OLP發生發展密切相關的生物學通路。同時利用OLP與對照組之間的差異表達基因進行蛋白質互作網絡的構建，并分析了其中的中心節點，進而從整體上探討了OLP發病過程中這些差異表達基因的相互關系。該網絡中心節點為GNB2L1，該基因又名RACK1(receptor for activated C kinase 1)[14]，該結果為該疾病的診斷和治療提供了研究方向。很多研究顯示該基因與很多腫瘤的預后及轉移密切相關， 如食管鱗狀細胞癌[15]、結腸癌[16]、甲狀腺乳頭狀癌[17]、非小細胞肺癌[18]等。而最近有研究顯示該基因在口腔鱗狀細胞癌發生發展中起到重要作用，如可以通過AKT/mTOR通路促進口腔鱗狀細胞癌進展[19-20]。有學者也人為口腔鱗狀細胞癌與OLP存在一定關聯[21-23]，結合本研究中Human eFP Browser[12]結果， Hub基因GNB2L1在口腔黏膜、舌組織中的表達最高(圖3)，提示其在口腔黏膜、舌組織中的有著重要作用。通過對口腔患者外周血檢查的檢查，發現OLP患者外周血中RACK1表達比對照組上升了近一倍，提示該基因RACK1與OLP的發生發展密切相關。

圖2 OLP相關蛋白質互作網絡

圖3 RACK1 在全身組織中的表達

圖4 RACK1 在外周血中的表達

本研究中發現在29 個生物學通路中，前十個生物學通路中就有兩個通路與G蛋白偶聯受體相關。如G蛋白偶聯受體信號通路(signaling by GPCR)、G蛋白偶聯受體下游信號(GPCR downstream signaling)，可見G蛋白偶聯受體與OLP有著密切的關系。G蛋白偶聯受體是很多信號轉導通路中常見的受體之一，有研究顯示一些G蛋白偶聯受體與OLP的發生發展密切相關，如 CD184/CXCR-4 跨膜趨化因子受體[24]、組胺4受體[25]等。另外臨床上糜爛性OLP往往容易產生惡變，而G蛋白歐聯受體與一些惡性腫瘤有著重要關系[26]。另外一條值得注意的通路為嗅覺信號通路(olfactory signaling pathway)，最新的一項病例對照研究顯示，OLP患者味覺功能相對于健康對照組有明顯下降，并具有統計學意義[27]，該功能在臨床上往往被患者及醫生忽視。

另外通過對差異表達基因的生物學過程進行分析，發現這些差異表達基因與免疫反應相關。這也再一次從側面提示免疫功能在OLP發生發展過程中的作用，符合OLP患者免疫功能存在一定的紊亂的觀點[28]。

除了上述通路和生物學過程外，本研究中所發現的其他一些生物學通路及生物學過程，目前還未有文獻報道，如類固醇代謝(steroid metabolism)、突觸小泡轉運(synaptic vesicle transport)等。其中類固醇代謝可能和OLP患者經常使用類固醇類藥物有關[29]。而突觸小泡轉運可能和OLP糜爛引起的疼痛神經反射引起[30]，但這些生物學過程在OLP發病過程中的具體作用還需進一步研究。