高蛋白水解率對芝麻香型白酒發酵過程及原酒品質的影響

高大禹，李一關，崔鳳嬌，田慶貞，張國順，陳建新*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司，江蘇 泰州，225300)

芝麻香型白酒生產技術巧妙的融合了“濃、清、醬”3種香型白酒的釀造工藝特點[1]，采用了泥底磚窖、清蒸續查、大麩結合、高氮配料、高溫堆積、高溫發酵、高溫流酒、長期貯存的工藝技術特點，使得其酒體風味特征具有了優雅、細膩、飄逸、回味悠長的類似焙炒芝麻的香氣，從而受到消費者的認可[2]。高粱作為主要原料，配以一定比例的小麥和麩皮，增加了芝麻香型白酒生產釀造原料的蛋白質含量和種類以及氨基酸的構成，為芝麻香型白酒風格的形成提供了基礎，也是其典型風格成功經驗的實踐總結[3]。高溫堆積和高溫發酵更是吸取了醬香型白酒的實踐經驗，促進蛋白質酶解及微生物代謝合成芝麻香氣基礎物質[4]。

每年白酒生產產生大量酒糟，而丟糟及回糟中殘留有約12%～18%蛋白質，糧食蛋白利用不足則會造成資源浪費及環境污染等問題[5]，解決好酒醅中蛋白水解問題非常重要。此前，FAN等[6-7]對中國白酒中蛋白的研究多集中在探討酒樣含氮類物質與酒樣品質的關系，而酒醅蛋白水解如何最終影響芝麻香型白酒酒樣含氮類物質種類、濃度和酒樣香氣品質的研究則少有報道。鑒于蛋白質水解過程復雜，本文通過在發酵過程中直接添加蛋白水解液的方式研究高蛋白水解率對芝麻香型白酒發酵過程及蒸餾原酒品質的影響，為解決白酒生產殘酒糟蛋白質含量高，原料蛋白利用率低等問題提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗原材料(高粱、小麥、麩皮、豆粕、曲粉、稻殼)，江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司；磷酸鹽、NaOH、葡萄糖、HCl、無水乙醚、正戊烷等試劑(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛、氨芐青霉素、制霉菌素，生工生物工程(上海)股份有限公司；二硫蘇糖醇，上海麥克林(Macklin)生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀、GC-2010 Plus氣相色譜儀，日本SHIMADZU公司；SHP-250生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；SIN-R200D無紙記錄儀，杭州聯測自動化技術有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DC-12氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司；50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛋白水解液的制備

稱取脫脂豆粕粉10 g，加入100 mL pH 7.5磷酸鹽緩沖溶液，水解底物豆粕終質量濃度為100 mg/mL，加入一定量酶活為100 U/mg的中性蛋白酶，在45 ℃的恒溫水浴中恒溫勻速攪拌，酶解6 h，酶解結束，于沸水浴中滅酶10 min使酶失活，自然冷卻，3 000 r/min離心25 min[8]。取上清液用于芝麻香型白酒堆積發酵和入窖發酵過程中。

1.3.2 蛋白水解液應用于芝麻香型白酒堆積發酵和入窖發酵

取0.87 kg豆粕水解液(水解液蛋白水解度達到26.28%，總含氮量占原料總氮10%)分別添加在芝麻香型白酒高溫潤糧階段、堆積24 h時、入窖發酵開始時以及發酵結束蒸酒前。共4個樣品，分別為潤糧階段加入樣、堆積24 h時加入樣、入窖發酵前加入樣和蒸酒前加入樣。堆積發酵和入窖發酵兩個階段均在實驗室控溫培養箱中開展。堆積過程取樣時間為堆積0、24、36、48 h，且采用先混勻再多點采樣的方式取樣。入窖發酵過程前10天每隔2 d取樣，后 20天， 每隔5 d取樣測定各指標變化，且采用多點取樣再混合均勻的方式取樣。每個樣品均平行測定3次。

1.3.3 酒醅中蛋白水解度變化測定

參考羅艷華等[9]用OPA法檢測不同水解物水解度的方法。測定不同堆積發酵階段加入豆粕水解液后酒醅蛋白水解度的變化。

1.3.4 酒醅微生物和理化指標測定

酒醅樣品微生物，酵母、細菌、霉菌、乳酸菌和芽孢桿菌的計數采用傳統平板培養法[10-13]。酒醅樣品理化指標：還原糖、酸度、淀粉、淀粉出酒率和含水率測定采用白酒酒醅分析方法[14-15]。酒精度采用氣相色譜(gas chromatography, GC)測定[16]，乙醇標準曲線：y=152 551.08x+2 765.12，R2=0.994。

1.3.5 酒樣感官品評、揮發性成分及含氮類物質定性與定量分析

發酵結束的4個樣品蒸餾所得酒樣采用暗杯盲評的方法進行[17]。

酒樣中揮發性成分的提取參考文獻[18]的方法；含氮類物質的提取與定性分析采用液液萃取結合氣質聯用(liquid-liquid extration-gas chromatographymass spectrometry, LLE-GC/MS)方法進行[19]；含氮類物質的定量分析采用頂空固相微萃取結合氣質聯用(head space-solid phase microextraction-GC/MS, HS-SPME-GC/MS)方法[6-7]。

2 結果與分析

2.1 不同樣品堆積發酵和入窖發酵過程微生物數量變化分析

如圖1所示，堆積發酵前期微生物處于適應酒醅環境的階段，代謝活動均較弱。從堆積24 h開始，微生物利用酒醅中營養物質開始大量繁殖代謝，分泌蛋白酶，降解原料蛋白為微生物更易利用的小肽、氨基酸等小分子物質，堆積24～36 h，潤糧階段加入樣和堆積24 h時加入樣由于補加了更容易被微生物利用的氮源和水分，酵母和芽孢桿菌增長速率和增長幅度均大于入窖前加入樣和蒸酒前加入樣。而霉菌數、細菌數和乳酸菌數差異不明顯。因此，堆積發酵，潤糧階段和堆積24 h時加入水解液較為明顯地促進了酵母和芽孢桿菌的繁殖。

A-潤糧階段加入樣微生物數量變化；B-堆積24 h時加入樣微生物數量變化；C-入窖發酵前加入樣微生物數量變化；D-蒸酒前加入樣微生物數量變化圖1 發酵過程微生物數量變化Fig.1 Microbial quantity change during fermentation

入窖發酵過程中，入窖發酵前加入樣在主發酵期(5～7 d)細菌數量相較于其他3個樣品有所增加，而酵母數下降速度快于其他3個樣品，可能是由于入窖前加入水解液造成細菌代謝產酸，加速了酵母的衰亡。此外，整個入窖發酵過程，總細菌數均有一定程度的下降，其結果與李小東等[10]的研究結果略有不同。入窖前大幅提高蛋白水解率使得入窖發酵過程酵母的衰亡速度加快。

2.2 不同樣品堆積發酵和入窖發酵過程各理化指標變化分析

如圖2-A所示，堆積發酵過程，堆積24 h加入樣還原糖下降速率最快，這與圖1-B中酵母增長速率快相一致，同時也可能與還原糖參與了美拉德反應或由芽孢桿菌代謝利用產生吡嗪類風味物質有關。并且堆積過程淀粉消耗達到3.83%為最高(表1)。此外，除堆積24 h時加入樣由于添加水解液致使含水率增大之外，其他樣品酒醅含水率均有所下降(圖2-C)。 酒精度、酸度的變化與李小東[10]等的結果相似。因此，堆積24 h蛋白水解率的提高加強了微生物產淀粉酶降解淀粉和酵母利用還原糖產酒精的能力。

A-酒醅還原糖含量變化；B-酒醅酸度變化；C-酒醅含水率變化；D-酒醅酒精度變化圖2 酒醅各理化指標變化Fig.2 Physical and chemical indexes change in fermented grains

入窖發酵主發酵期，除入窖發酵前加入樣，潤糧階段加入樣、堆積24 h時加入樣和蒸酒前加入樣酵母利用還原糖發酵產生大量酒精，與曹維超等[20]研究結論一致。而入窖發酵前加入樣在入窖發酵前補加水解液，致使細菌、芽孢桿菌和乳酸菌快速生長代謝，造成酒醅酸度前期快速上升(圖2-B)，從而抑制了酵母活性，影響了酒精的產生，其酒精濃度只有2.23%， 低于潤糧階段加入樣(6.03%)、堆積24 h時加入樣(4.67%)和蒸酒前加入樣(5.49%)(圖2-D)，且淀粉出酒率僅有15.12%(表1)。此外，蒸酒前加入樣淀粉出酒率達到了最高51.17%，發酵過程未補加水解液，微生物代謝活動平緩，可能有利于更多的可發酵性糖轉化為酒精。入窖前加入蛋白水解液，使得酒醅酸度快速上升，從而降低了出酒率。

表1 各樣品淀粉含量變化和出酒率差異性比較Table 1 Comparison of starch content and liquor yield among different samples

2.3 不同樣品發酵過程蛋白水解度變化

如圖3所示，堆積發酵階段，除潤糧階段加入樣可能在高溫蒸糧階段氨基氮發生了物理轉化致使初始蛋白水解度低，其他3個樣品蛋白水解度變化不明顯。潤糧階段，高蛋白水解率明顯降低了堆積過程初始蛋白水解度。

入窖發酵階段，前6天，酵母和細菌代謝旺盛，蛋白迅速被微生物降解，各樣品蛋白水解度均快速增加。6～25 d，各水解液加入樣品可能因為死亡酵母菌體蛋白的暴露及細菌等微生物產酶對蛋白的降解造成蛋白水解度又開始增加。發酵25～30 d，蛋白水解度又開始下降，可能與芽孢桿菌的生長繁殖消耗了氮源有關。

圖3 堆積發酵和入樣發酵蛋白水解度變化Fig.3 Variation of the degree of hydrolysis of accumulation and cellar fermentation

2.4 不同酒樣感官品評、揮發性成分及含氮類物質定性與定量分析

2.4.1 酒樣感官品評

酒樣感官品評結果如表2所示，梅蘭春酒廠酒樣芝麻香、焦糊香和口感勻稱協調，潤糧階段加入樣酒樣焦糊香突出，可能是潤糧階段加入的氨基氮經過蒸糧過程帶入的，影響了芝麻香典型性的表現。堆積24 h 蛋白水解液的加入促進了酵母和芽孢桿菌代謝，酒樣酸味稍明顯但醇甜感強。

表2 不同酒樣品評結果Table 2 Sensory evaluation of different liquor samples

入窖發酵前加入樣酒樣酸味突出，香氣悶雜，后味苦，主要是因為蛋白水解液的加入使其主發酵期細菌代謝產酸較多，酒樣不合格；而蒸餾前加入水解液使得酒醅水分增大，影響了蒸酒前加入樣酒樣的噴香感，味略寡淡。品評結果表明，堆積發酵過程高的蛋白水解率增強了焦糊香的放香效果，而入窖發酵過程高的蛋白水解率對酒質是極其不利的，酒樣不合格。

2.4.2 不同酒樣揮發性成分分析

經HS-SPME-GC/MS分析各樣品揮發性成分，結果如圖4所示，經聚類分析，潤糧階段加入樣酒樣和入窖發酵前加入樣酒樣、堆積24 h時加入樣酒樣和蒸酒前加入樣酒樣相似度較高，并且四樣酒樣與梅蘭春酒廠酒樣相比各風味物質相對豐度有了較大提升，反映了高的蛋白水解率增加了最終酒樣揮發性成分的種類和含量。

酯類物質是所有酒樣中最為豐富的，各餾酒酒樣棕櫚酸乙酯含量均超過3 500 μg/L，貢獻類似奶油香氣。梅蘭春酒廠酒樣己酸乙酯(7 978.33 μg/L)含量遠高于其他樣品，這可能與生產窖池窖底窖泥己酸菌代謝有關。堆積24 h時加入樣酒樣(22 982.58 μg/L)和入窖發酵前加入樣酒樣(20 797.36 μg/L)酯類物質總濃度高于潤糧階段加入樣酒樣(12 440.56 μg/L)和蒸酒前加入樣酒樣(14 826.2 μg/L)，尤其是3-甲基-1-丁醇乙酸酯，原因可能是堆積后期和發酵初期微生物代謝活動較強，易利用氮源的補加促進微生物代謝產生了更多的酯香類物質。

異戊醇是醇類物質中含量最高的，質量濃度均達到了30 mg/L，是芝麻香風格區別于其他香型酒的關鍵風味物質[21]。蒸餾前加入蛋白水解液帶入的水分可能是造成蒸酒前加入樣酒樣中醇類物質總濃度小于其他幾個樣品并且味寡淡的主要原因。苯甲醛和苯乙醛濃度在檢測到的酒樣中是醛類含量最高的兩種，兩種醛類在堆積24 h時加入樣酒樣、入窖發酵前加入樣酒樣和蒸酒前加入樣酒樣中的濃度要明顯高于梅蘭春酒樣和潤糧階段加入樣酒樣，推測高的蛋白水解率有利于發酵過程醛類的產生。乙偶姻是醬香型白酒風味物質四甲基吡嗪形成的前體物質[22]，由枯草芽孢桿菌經糖酵解代謝過程與微生物酶協同作用產生，且在各樣品中均有檢測到。各樣品中均檢測到2,4-二叔丁基苯酚，并且在潤糧階段加入樣酒樣和堆積24 h時加入樣酒樣中濃度要高于其他。含硫化合物主要由含硫氨基酸(如半胱氨酸等)降解形成，二甲基三硫僅在入窖發酵前加入樣酒樣和蒸酒前加入樣酒樣中被檢測到，且二甲基三硫可能是在蒸餾階段由甲硫醇合成的[23]。由此推測，高的蛋白水解率可能有利于提高風味物質的種類數量，對兩種醛類物質苯甲醛、苯乙醛的濃度提升明顯，另外，堆積發酵階段高蛋白水解率也增加了酚類物質的濃度，入窖發酵階段高蛋白水解率可能更有利于二甲基三硫前體物質甲硫醇的產生(詳細內容參見http:∥kns.cnki.net/KCMS/detail/11.1802.TS.20190102.1412.021.html)。

圖4 不同樣品風味成分對比熱圖Fig.4 Comparison of volatile aroma compounds in different samples

2.4.3 各樣品含氮類物質定性、定量結果分析

2.4.3.1 含氮類物質定性分析

不同酒樣經LLE-GC/MS分析，定性結果如表3所示。

表3 含氮類物質定性結果Table 3 Qualitative results of nitrogenous substances

注：“+”表示含有此種物質；“—”表示不含此種物質。

從表3可得出，共檢測出17種含氮類物質，包括12種吡嗪類、3種吡啶類和2種噻唑類。吡嗪類化合物對形成白酒香氣有特殊的風味貢獻作用[22，24]，經二羰基化合物與氨基酮縮合雜環化反應生成(即美拉德反應)，或者微生物協同代謝產生(即氨基酸在微生物代謝產生的氨基酸脫氫酶作用下形成氨，氨與還原酮類反應生成)。以醬香型白酒為代表，由枯草芽孢桿菌生物代謝產生的2,3,5,6-四甲基吡嗪的藥理作用為中國白酒賦予了一定的健康功效[22]，表3中，各個樣品也均有檢測到2,3,5,6-四甲基吡嗪。潤糧階段加入樣酒樣和堆積24 h時加入樣酒樣未檢測到噻唑類，入窖發酵前加入樣和蒸酒前加入樣未檢測到吡啶類，由此推測堆積過程高蛋白水解率有利于吡啶類物質的產生，而入窖發酵過程高蛋白水解率有利于噻唑類物質產生。此外，2-乙基-6-甲基吡嗪是梅蘭春芝麻香型白酒中含量高且貢獻較大的吡嗪類物質，對其芝麻香風格的突出起到重要的作用。

2.4.3.2 含氮類物質定量結果與分析

5種酒樣經HS-SPME結合GC/MS定量分析結果如表4所示。

表4 含氮類物質定量結果 單位:μg/L

對芝麻香型白酒中色譜分析響應值較高的5種吡嗪進行了定量，定量結果表明，梅蘭春酒廠酒樣中吡嗪類物質含量最高，為2,6-二甲基吡嗪245.89 μg/L，其次為三甲基吡嗪，這與金佩璋[25]在文獻中報道的結果是一致的。4個階段加入樣酒樣中，吡嗪化合物含量較梅蘭春酒廠酒樣均有了較為明顯的增加，氮源的加入促進了微生物的協同代謝作用。尤其是堆積24 h時加入樣和入窖發酵前加入樣酒樣，2,6-二甲基吡嗪含量分別達到了549.35、840.67 μg/L，可能是堆積后期和主發酵期高溫條件有利于2,6-二甲基吡嗪的生成[26]。而餾酒前加入樣酒樣中2-乙基吡嗪含量最高。此外，2,3,5,6-四甲基吡嗪作為具有健康功能性風味物質，濃度也較梅蘭春酒廠酒樣有較大的提升，尤其是入窖發酵前加入樣，另外，入窖前加入樣2,5-二甲基吡嗪含量較高，可能是豆粕蛋白水解帶來的蘇氨酸經枯草芽孢桿菌代謝生成。因此可以得出，高蛋白水解率有效地提高了酒樣中吡嗪類物質的濃度。

3 結論

(1)堆積發酵過程，高蛋白水解率不僅加快了酵母和芽孢桿菌的繁殖速率，也提高了微生物對淀粉和還原糖的利用效率，而潤糧階段加入則顯著降低了堆積起始蛋白水解度。入窖發酵過程，入窖前提高蛋白水解率使得細菌代謝產酸，抑制酵母活性，加速了酵母的衰亡，降低了出酒率。而餾酒前加入水解液，更多的可發酵性糖轉化為酒精，淀粉出酒率最高。

(2)酒樣風味物質綜合分析結果表明，堆積發酵過程，高的蛋白水解率增大了焦糊香的放香效果，提高了酚類物質的濃度，并且利于吡啶類物質的產生。入窖發酵過程，高蛋白水解率有利于噻唑類物質和二甲基三硫的產生。另外，入窖發酵前添加蛋白水解液會使酒醅酸度快速上升，酒樣不合格。總之，高的蛋白水解率可能有利于提高風味物質的種類數量，對2種醛類物質苯甲醛、苯乙醛的濃度提升較明顯，同時也顯著提高了吡嗪類物質的濃度，但風味卻因此受到了一定的影響。本研究主要以脫脂豆粕蛋白水解液為對象，通過不同發酵階段、固定添加量的方式進行探討，由于時間的限制，后續的研究者還可以從更多的蛋白種類、不同的添加量及分批添加等方式來進一步研究蛋白水解與芝麻香型白酒酒體品質之間的關系。