基于肝細胞癌微環境和生物標志物特點構建靶向性納米載體的研究與應用

李鎮利，吳寒，楊田，吳孟超

（第二軍醫大學東方肝膽外科醫院 肝膽外科，上海 200438）

隨著納米技術的不斷發展，納米材料在腫瘤的診療領域扮演著越來越重要的角色。鑒于納米材料的尺度效應、表面效應以及光、聲、電、磁等方面的特性，相比于傳統的治療模式具有更加廣闊的前景[1-3]。腫瘤血管的病理生理特性，是納米顆粒發揮其優勢的結構基礎。腫瘤區域血管相比于正常血管，結構完整性差，具有更寬的血管內皮間隙。通常將載體粒徑在10～200 nm可較好地通透血管壁并滯留在腫瘤組織中的過程稱之為腫瘤血管的高通透長滯留效應（EPR效應），這是納米藥物能在腫瘤組織中選擇性分布，具有較好靶向性和低毒副作用的前提[4]。納米材料的靶向作用主要包括被動靶向和主動靶向效應[5]。被動靶向效應指的是基于EPR效應使納米級別的生物材料被動富集于腫瘤區域，而主動靶向效應則指的是通過在納米材料上連接特異性的配體，與腫瘤微環境中的特征性受體結合，進一步提高腫瘤富集量，減少對正常組織的毒副作用。隨著納米材料在醫學領域研究越來越廣，基于EPR的被動靶向效應并不能滿足目前基礎和臨床研究的需要，而基于腫瘤微環境特點設計的主動靶向納米載體被越來越多地設計出來，并且與傳統被動靶向相比，在基礎研究中展現出了更加優越的效果。

原發性肝癌（主要指肝細胞癌，HCC）是全球第五大高發的惡性腫瘤，其致死性更是高居第二位[6]。作為惡性程度較高，預后差的惡性腫瘤，肝癌在腫瘤微環境和生物標志物方面有其特征性的表現，并且已有研究基于這些特征性靶點設計出了許多分子靶向性的藥物[7]，如索拉菲尼、瑞格菲尼等[8]。盡管在患者生存時間方面優于傳統的化療藥物（中位生存時間僅延長3個月），但仍然無法避免全身毒副作用大，遠期療效不佳的問題[9]。所以，靶向性強、毒副作用小的納米載體與肝癌微環境和生物標志物的結合受到了較大的重視，并在基礎研究中取得了良好的效果。本文將對肝臟攝取納米顆粒的特性以及基于肝癌微環境和生物標志物特點構建靶向性納米載體的研究進展作一綜述。

1 肝臟攝取納米顆粒的特性及結構調控

盡管納米顆粒相比于傳統藥物，具有較好的腫瘤富集特性，但肝臟對于外來物質的屏障作用是其面臨的一大問題。研究表明，通過口服或靜脈注射的納米藥物，會大部分沉積在肝脾部位，并被代謝排出體外，導致生物利用度降低，治療效果遠低于預期，甚至會造成肝臟毒性，引起一系列代謝性的問題。肝臟攝取納米顆粒的結構基礎是由Kupffer細胞組成的網狀內皮吞噬系統（RES），進入血液循環的納米顆粒首先會與血漿蛋白結合，接著被迅速調理素化，并進一步介導巨噬細胞的內吞作用，使其在肝內沉積，不能再次進入血液循環[10]，具體的步驟如圖1所示[10]。

圖1 肝臟吞噬納米粒子的結構基礎（左）和PEG化修飾逃逸RES示意圖（右）[10]

為了實現RES逃逸，科學家對納米載體進行了多種功能化的修飾，削弱肝臟對納米顆粒的屏障作用，以更好的發揮其效果。目前，聚乙二醇（PEG）化是納米材料最普遍的修飾策略，能避免與血漿蛋白的結合，進而阻斷調理素化過程，逃逸RES的吞噬作用。PEG化還能延長血液循環時間，改善生物相容性，已成為公認有效的改性方法[5]。此外，研究通過多光子熒光顯微鏡實時觀察肝臟攝取納米顆粒后發現，肝臟的清除作用還與納米粒子的疏水性、表面電荷及大小有關[11]，帶負電荷的顆粒更易被RES吞噬，造成肝臟毒性，而親水性基團則有利于逃逸肝臟的屏障作用。另一項研究系統評估了納米顆粒的大小對肝臟攝取的影響[12]，發現直徑為60 nm的納米顆粒最有利于腫瘤的富集，直徑的增加或減少均會一定程度增加RES的沉積。近期研究從器官結構、血流動力學和細胞表型的角度深入分析了肝臟作為納米顆粒屏障的原因和策略，結果表明，納米顆粒更容易在血管入路周圍富集；肝血竇內血運豐富，血流交換面積大導致血流速度慢是納米顆粒易于在肝內沉積的重要原因；此外，肝脾臟器內巨噬細胞的表型對納米顆粒的攝取量也起到了決定性的作用，巨噬細胞在肝脾內分別分化成Kupffer細胞和紅髓細胞，相比于普通巨噬細胞，其吞噬作用明顯增強[13]。

因此，肝臟作為納米顆粒沉積的主要器官，是制約納米藥物發揮作用的主要屏障，而隨著現有技術對肝臟攝取納米顆粒的機制研究以及相對應的結構調控，能夠找到更加合理的改進手段。現有研究正是得益于這類技術的發展，才進一步針對肝癌微環境特點，設計出特異性更強的納米載體，拓寬了納米醫學在肝癌診療領域的應用前景。

2 肝癌微環境的特點與相應的納米載體功能化設計

納米顆粒的功能化設計的目的一方面在于逃逸RES的吞噬，延長血液循環時間，提高生物利用效率，如上述所示；另一方面在于結合肝癌微環境的特性，賦予納米顆粒相應的功能化修飾，實現更好的腫瘤響應性和靶向性。除上述提到的腫瘤血管區域的特征性變化外，目前還從根據肝癌腫瘤的酸性環境、谷胱甘肽含量高、腫瘤間質的高滲透壓、腫瘤組織乏氧性等特點進行功能化設計。

2.1 酸性環境

腫瘤區域的pH（6.5）略低于正常組織（7.4），而腫瘤細胞內的內涵體或溶酶體則更低（5.0～5.5）[14-16]。在正常的組織內，H+由糖酵解，谷氨酰胺分解以及ATP水解產生，能夠通過轉運進入血流，保證組織內的中性環境，而在腫瘤組織內，高負荷的糖酵解過程導致乳酸堆積，形成酸性環境。此種差異為設計pH相應藥物輸運系統提供了基礎，研究通過在納米載體表面包覆聚電解質層，使其結構在酸性條件下遭到破壞，進而實現藥物的響應性釋放[17]。近期研究發現，以納米材料為化療藥物載體的載藥體系能在酸性環境下顯著加速藥物釋放，并且在肝癌細胞系和肝癌模型上系統驗證了該體系響應性釋藥特性和靶向輸運性能[18]。

2.2 谷胱甘肽含量高

谷胱甘肽（GSH）是人體細胞內具有重要功能的還原性天然活性肽，在腫瘤細胞內和正常細胞內的濃度差異較大（4∶1）。二硫鍵能穩定存在于人體血液中，而在腫瘤細胞內則被高濃度GSH降解。因此，利用二硫鍵對腫瘤高濃度GSH的降解性而設計的納米載體具有廣闊的前景[19-21]。研究通過合成有機無機雜化納米硅球（摻雜二硫鍵結構），能得到腫瘤區域內GSH響應性降解的藥物載體[22]。在此基礎上，通過連接肝癌特異性配體，設計出了靶向性強，并且具有GSH響應性降解+釋藥性質的納米載體，有效地增強了肝癌化療的療效，降低了全身毒副反應[23]。

2.3 腫瘤間質的高滲透壓

肝癌組織滲透壓（IFP）的升高主要源于血管、淋巴管道的異常、EPR效應等導致腫瘤間質過度增長引起[24-25]，腫瘤中心位置往往壓力最高，向外周逐漸降低[26-27]。IFP升高一方面促進了腫瘤生成和轉移，另一方面導致藥物和納米載體很難進入腫瘤細胞發揮作用，影響其治療效果[28-31]。研究發現，通過抑制肝癌間質成纖維細胞（形成腫瘤間質的主要成分）的生長，能夠有效降低IFP，并且提高納米載體的攝取率，增強藥物治療的效果[32]。此類研究說明納米載體不但在增強腫瘤藥物靶向性方面意義重大，在改善腫瘤微環境方面同樣優于傳統的治療手段。

2.4 腫瘤組織乏氧性

腫瘤組織的乏氧特性主要是由于腫瘤細胞高負荷的糖代謝，使葡萄糖轉運體異常活躍，遠遠超過正常組織的氧氣供應導致。乏氧特性參與了包括肝癌細胞增殖、血管形成、轉移、化療耐藥在內等多個重要的過程：一方面乏氧狀態可能會加劇腫瘤增殖和轉移；另一方面通過聯合乏氧特異性藥物，可以實現提高腫瘤化療的療效。有研究將乏氧響應性物質偶氮苯修飾的納米顆粒應用于腫瘤的基因治療，在提高藥物靶向作用的同時，還有效地增加了腫瘤細胞對siRNA的吞噬效率，達到了可觀的抗腫瘤效果[33]。

3 肝癌生物標記物與納米材料表面功能化設計的結合

上述微環境特點多是腫瘤組織所共有，缺乏肝癌特異性。相比于其他腫瘤，肝癌細胞會特征性表達多種膜蛋白分子，如圖2[34]所示。這種特異性的蛋白常常用于肝癌的早期檢測，而在納米醫學領域，這種特性對于納米載體的表面修飾和功能化設計同樣至關重要，以下將重點闡述幾種廣泛應用于納米載體的肝癌特異性膜蛋白分子。

圖2 肝癌細胞表面特征性膜蛋白受體示意圖[34]

3.1 聚糖蛋白-3（GPC-3）

GPC-3是屬于硫酸肝素蛋白多糖家族的一種膜蛋白，常在肝癌組織中異常表達。據報道，74.8%的HCC會出現GPC3 mRNA的異常表達，而僅有3.2%在正常肝組織表達，證明了其高度的特異性，可作為納米載體的高效靶點。研究發現，基于GPC-3單克隆抗體GC33修飾的納米材料，能顯著抑制GPC-3陽性的Hep G2和Huh 7細胞系的腫瘤生長，而對于GPC-3陰性的SK-HEP-1細胞系，則沒有明顯的改變[35-36]。另外一項以HepG2（GPC3表達上調）和HLF（GPC3表達含量低）為研究對象的研究也證實了GPC-3良好的靶向性[37-38]。

3.2 生長抑素受體（SSTRs）

SSTRs是G蛋白偶聯的一類跨膜蛋白，在不同組織中表達含量差異較大。研究顯示，SSTRs常見于肝臟疾病比如急慢性肝炎、肝硬化和HCC，其中HCC占據41%，而極少表達于正常肝組織[39]。鑒于SSTRs良好的腫瘤特異性，有研究將奧曲肽作為SSTRs的特異性配體，并共價修飾在載有阿霉素的納米載體-脂質體上，利用奧曲肽和SSTRs的特異性識別和結合過程，成功從體外和體內實驗驗證了其對肝癌組織良好的靶向效果[40]。

3.3 整合素相關蛋白（CD47）

CD47是一種膜蛋白，常在肝細胞癌和膽管細胞癌組織中高表達，并且能夠與巨噬細胞表面的信號通路蛋白（SIRP-α）特異性結合，介導細胞吞噬作用，這可作為納米材料與肝癌細胞特征性結合的分子基礎。有研究將納米載體修飾上CD47配體片段4N1K后，將其作為肝癌組織熒光染色的工具，并在肝癌細胞和患者病理組織中驗證了其應用價值[41]。相比于傳統的免疫熒光法，該手段更加經濟高效，具有很高的臨床轉化價值。

3.4 αvβ3整合蛋白

αvβ3是血管生成和腫瘤形成過程中，血管內皮細胞高表達的一種最普遍的蛋白[42]，而少見于正常的血管內皮細胞，其作用在于能夠招募血管內皮生長因子，誘導血管形成[43]。研究已證實這類蛋白可在多個肝癌細胞系中高表達，成為應用較多的治療靶點[44]。三氨基酸肽（RGD）可以作為該靶點的有效配體，研究發現RGD修飾的納米載體能首先聚集在腫瘤血管周圍[45]，并進一步介導腫瘤細胞的內吞作用，增加腫瘤細胞的吞噬量，提高治療的效果[46]。此外，近期研究通過對MXene納米片進行介孔氧化硅包裹，成功地將RGD共價連接到了MXene載體上，并且在肝癌細胞和動物模型上系統地驗證了其優越的靶向性能，可以比對照組的腫瘤靶向效率提高1.6倍[18]。

綜上所述，目前基于肝癌特有的微環境特點（酸性，高濃度谷胱甘肽，間質高滲透壓和乏氧狀態等）以及細胞表面分子標志物（GPC-3，SSTRs，CD47和αvβ3蛋白等），已成功構建出一系列具有優越靶向性能的納米載體，并且在基礎實驗階段已經證實其良好的靶向作用，在肝癌的高效診斷和治療領域具有很高的臨床轉化前景和應用價值。