水稻OsDUF393基因編輯突變體的創建

王荃 石雨鷺 邳瑞雪 孔曉聰 靳亞軍 梁閃閃 張泗舉 欒維江

（天津師范大學生命科學學院/天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；第一作者：wanghanmada＠163．com；*通訊作者：lwjzsq＠163．com）

未知功能結構域蛋白家族（domains of unknown function protein families，DUFs）是一大群功能未知的蛋白家族。生物信息學分析發現，大約3 700多個未知功能結構域蛋白家族存在于蛋白家族（Pfam27．0版）數據庫中，占據了整個蛋白家族的25%左右[1]。大量轉錄譜和蛋白譜分析顯示，DUFs蛋白對生物的生長發育發揮著重要作用。對這些基因的研究將有助于對生物體復雜的生命活動進行更深入的了解[2]。在植物中，DUF家族成員的功能報道較少。目前已有的DUFs基因生物學功能研究主要集中在模式植物擬南芥和水稻中。根據已有研究發現，DUFs家族基因與植物的生長發育及非生物脅迫應答密切相關。在擬南芥中，DUF784家族基因能夠調控花粉發育，利用RNAi技術降低擬南芥DUF784家族基因的表達水平，在RNAi轉基因株系中出現胚珠敗育的表型[3]。DUF579家族基因IRX15和IRX15-L參與半纖維木聚糖的合成，影響擬南芥次生細胞壁形成[4]。擬南芥DUF642家族基因DGR1和DGR2參與了擬南芥對抗壞血酸合成末端前體L－GalL的響應，并互補表達影響著擬南芥葉的擴展和根的伸長[5]。擬南芥硫氧還蛋白DCC1屬于DUF393家族，定位于線粒體中，在愈傷組織中表達較高。它可以通過氧化還原調節ROS穩態平衡進而調節擬南芥的芽再生過程[6]。已報道的水稻DUF966家族成員OsDSR2的表達明顯受到干旱、高鹽等非生物脅迫條件的抑制[7]，該基因的過表達增強了水稻對PEG6000和高鹽脅迫的敏感性。水稻DUF1644家族基因OsSIDP409的超量表達可以提高轉基因植株的抗氧化脅迫能力，提高了植株的耐鹽性[8]。水稻幼小花序和小穗的內外稃中DUF640家族基因BSG1強烈表達，它對水稻的內外稃發育、籽粒形狀和大小都起著正調控作用[9]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術已廣泛的應用于基因功能研究中，通過該技術可以對基因組DNA進行編輯，創建突變體，從而進行基因功能的研究。1987年，日本大阪大學的實驗室在研究大腸桿菌的堿性磷酸酶基因時發現該基因編碼區下游存在一段串聯間隔重復序列，該序列包括14個29 bp的重復片段和32～33 bp的間隔序列[10]。2002年，MOJICA等[11]將含有該特點的序列命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）。2005年發現，這類重復結構廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，預測其來源是原核生物在進化過程中針對噬菌體等外源基因的獲得性免疫防御機制[12]，該系統簡稱為CRISPR/Cas9系統。根據結構不同，CRISPR/Cas9系統分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3種不同類型[13]?，F在最簡單、應用最廣泛的是Ⅱ型。該系統由3部分組成：Cas9核酸酶、前體crRNA（pre－crRNA）和反式激活 crRNA（tracrRNA）。tracrRNA與pre－crRNA的重復序列配對，引導pre－crRNA加工，生成crRNA－tracrRNA復合體。在前端20 bp靶點序列的引導下，Cas9蛋白特異切割目的序列。2013年，CONG等[14]首次報導該系統定點突變人類293T細胞EMX1和OPVALB基因及小鼠細胞的Th基因，其在基因組進行特異性切割。之后CRISPR/Cas9系統成功應用于家蠶、果蠅、酵母、斑馬魚等多個物種的內源基因定點編輯[15]。高彩霞等[16]利用CRISPR/Cas9系統實現了對水稻中OsPDS、OsBADH2、OsMPK2和Os02g23823等4個基因的定點突變，水稻轉基因植株中的突變率為4．0%～9．4%，證明CRISPR/Cas9系統能夠用于植物基因組編輯。后來眾多科學家對該系統進行了優化，并高效用于水稻的基因編輯中[17－20]。

為了揭示水稻中DUF家族基因的功能，本文利用CRISPR/Cas9技術構建了水稻 DUF家族成員Os－DUF393的編輯載體，通過農桿菌介導的遺傳轉化方法[21]，獲得一系列穩定遺傳的OsDUF393基因編輯突變體，并通過測序對其突變類型進行分析，為探究水稻OsDUF393基因功能提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料

以粳稻品種中花11和轉基因材料用于本實驗。所有材料種植于天津師范大學試驗田及海南陵水南繁基地，田間保持常規管理。

1.2 靶向編輯位點的引物設計

利用 NCBI（http://www．ncbi．nlm．nih．gov/）數據庫查詢OsDUF393基因及蛋白序列，并用E－CRISPR網絡軟件預測目的基因的打靶效率，在目的基因的編碼區中查找符合GN（19）NGG的序列作為編輯的靶點。本實驗在基因OsDUF393的第1個外顯子和第2個外顯子各設計1個靶點，并對設計的2個靶點進行BLAST比對，保證其特異性。2個靶點的引物序列為DUFC1F：5 "－GTGTGGCGAGCTCGCTGGCACGCA －3 "；DUFC1R：5 "－AAACTGCGTGCCAGCGAGCTCGCC －3 "；DUFC2F：5 "－GTGTGTTCACTCTGACGTCAAAGT －3 "；DUFC2R：5 "－AAACACTTTGACGTCAGAGTGAAC－3 "。

1.3 CRISPR/Cas9載體構建

將合成的正反向引物各取10 uL混至1個管，放入PCR儀中退火。將退火產物進行回收后與用BbsⅠ酶切的Os－U6SK質粒骨架過夜連接獲得sgRNA重組載體，并對重組載體進行PCR鑒定，所用特異引物分別為：M13F與靶點序列下游引物 DUF393－C1R和M13F與靶序列下游引物DUF393－C2R。將獲得的sgRNA融合載體及含有Cas9的Cas9－sk空載體分別用載體相應的限制性內切酶進行酶切，回收酶切產物并將其連接到pCAMBIA1300雙元載體中，獲得重組載體。

1.4 轉基因植株的獲得及分子鑒定

將構建的重組雙元載體轉入農桿菌，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得轉基因植株。待轉基因植株移至大田，收集轉基因植株葉片，用CTAB法提取水稻基因組DNA[22]，以載體中選擇標記潮霉素特異性hygF/R引物對其進行PCR分子鑒定，引物序列為hygF：5 "－GGAGCATATACGCCCGGAGT－3 "；hygR：5 "－GTTTATC GGCACTTTGCATCG－3 "。

1.5 轉基因植株的突變位點及測序分析

在目的基因靶位點上下游250 bp左右設計特異性檢測引物，以轉基因植株基因組DNA為模板進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。對于測序分析，首先利用混池方法，將提取的轉基因植株的DNA每5株混成1個樣品，進行PCR擴增，PCR產物送至生物公司測序。根據測序結果，再將產生編輯的混池樣品進行單株測序，利用在線軟件DSDecode（http://dsdecode．scgene．com/）對突變位點進行解碼，分析每株轉基因植株的突變情況。所用引物序列為MA1F：5 "－TGCGGGCTAATCCAACGGTT －3 "，MA1R：5 "－CGATTA CCAGCAGGCAACAG －3 "；MA2F：5 "－CTCTGATGCGTT TGCCCATT－3 "，MA2R：5 "－TTGTCCCTTGCCACACCAG T－3 "。

1.6 基因的表達分析

對于目的基因的組織特異性表達分析，田間收集野生型不同組織器官，包括莖頂端分生組織、葉、根、莖和不同時期幼穗，提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，利用RT－PCR分析目的基因在不同組織器官中的特異性表達。對于編輯突變體的表達分析，提取T1代田間生長60 d的編輯突變體的葉片總RNA，利用M－MLV反轉錄酶進行反轉錄獲得cDNA，用目的基因OsDUF393基因特異性引物進行RT－PCR表達分析，引物序列為TestF：5 "－ACTCTCCACAAGACAATCAG－3 "；TestR：5 "－ATCATCTTTGCATTCGGCTG－3 "。

圖1 OsDUF393基因的結構及編輯位點設計

圖2 OsDUF393基因CRISPR/Cas9編輯載體構建

圖3 OsDUF393基因CRISPR-Cas9轉基因植株的分子檢測

2 結果與分析

2.1 OsDUF393序列分析及靶位點的選擇

為了探索水稻基因OsDUF393的功能，用CRISPR/Cas9技術靶向編輯該基因的CDS序列。通過水稻基因組注釋數據庫（http://rice．plantbiology．msu．edu/）查詢到OsDUF393基因的全長編碼序列，含有8個外顯子、7個內含子，編碼1個209個氨基酸的蛋白質（圖1）。對基因結構域進行分析，發現該基因隸屬于DUF393家族。進一步分析OsDUF393基因序列發現，第3～8個外顯子的序列較短且找不到合適的靶位點。利用在線軟件E－CRISPR[23]在第1個及第2個外顯子發現了效率高、特異性好的sgRNA靶位點。據此設計了2個靶向編輯位點，分別命名為 target 1（TG1）和 target 2（TG2）。

2.2 OsDUF393基因CRISPR/Cas9編輯載體的構建

根據上述靶點的設計，將經退火的引物連接至O－sU6－SK載體上，獲得有OsDUF393特異識別的sgRNA融合載體，分別為 OsU6－SK－TG1 和 OsU6－SK－TG2。將載體熱激轉化至大腸桿菌中，挑取單克隆進行PCR鑒定，凝膠電泳結果證實擴增出的片段大小為400bp左右，與預期結果一致（圖2－A），表明目的靶點已成功連入了OsU6－SK空載體。同時對連接成功的融合載體進行測序確認，結果表明，OsDUF393基因的靶序列已成功連接到了OsU6SK載體上。將構建好的融合載體OsU6－SK－TG1、OsU6－SK－TG2，含有 Cas9 的 35SCas9－SK載體及pCAMBIA1300雙元載體，分別酶切回收，將回收產物進行三片段連接（圖2－B），從而將帶有特異靶點的sgRNA及Cas9表達盒共同構建到用于植物轉化的雙元載體pCAMBIA1300中。將連接成功的重組載體進行質粒酶切鑒定，結果表明，重組載體切出了預期的目的片段，片段大小正確（圖2－C），表明2個目的片段已成功連入了pCAMBIA1300空載體中。

2.3 轉基因植株的獲得和分子檢測

通過農桿菌介導的遺傳轉化方法，將2個靶點（TG1和TG2）的雙元載體分別導入野生型中花11中，最終獲得3個line的TG1轉基因植株30株，8個line的TG2轉基因植株70株。經潮霉素抗性基因鑒定，100株轉基因植株均為轉基因陽性植株（圖3）。

2.4 編輯突變體的突變位點分析

為了驗證轉基因植株中的目的基因OsDUF393是否被編輯，我們首先采用混池方法（BSA,bulked segregant analysis）進行檢測，從轉基因植株中提取基因組DNA，每5株DNA作為1個混池進行PCR擴增，然后將PCR產物純化后進行測序分析。獲得的30株TG1轉基因植株共分為6組進行測序，編號為TG1－1～TG1－6；70株TG2轉基因植株共分為14組進行測序，編號為 TG2－1～TG2－14。測序結果發現，TG1－3 和TG2－8出現套峰（圖4）。測序結果峰圖顯示，套峰出現在PAM序列（該序列為NGG，N為任意堿基）附近，說明這2組混池中目的基因OsDUF393可能被編輯。

圖4 轉基因植株混池測序分析

圖5 編輯突變體的測序分析及PCR驗證

圖6 OsDUF393基因的組織特異性表達

為了進一步驗證突變位點，將TG1－3和TG2－8兩組樣品，即10個單株的PCR產物，單獨測序。結果顯示，TG1－3 中有 3 株發生突變，突變體編號為 1#、2#、3#。TG2－8中有1株發生突變，突變體編號為4#。對這4個突變體進行測序解碼分析，發現1#編輯突變體是1個單堿基插入的雜合突變體，在PAM序列－4區插入了1個A堿基（圖5A）。2#編輯突變體含有1個62 bp缺失的雜合突變體，PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，可以擴增出2條清晰的條帶（圖5B），對這2條帶進行測序發現兩者之間有62 bp缺失（圖5B）。3#編輯突變體是1個純合缺失突變體，PCR檢測發現其產物比野生型小了41bp（圖5C）。4#編輯突變體也是1個單堿基插入的雜合突變體，在PAM序列－2區插入了1個A堿基（圖5D）。

2.5 OsDUF393基因在水稻中的組織特異性表達分析

為了進一步探究OsDUF393基因功能，利用RTPCR分析了目的基因在水稻不同器官中的表達情況。分別提取水稻莖頂端分生組織、葉、根、莖和不同時期幼穗的總RNA，反轉錄后進行表達分析。結果表明，OsDUF393主要在水稻葉片中表達，在其他組織器官中的表達非常微弱，很難檢測到（圖6），暗示了Os－DUF393是葉片特異表達的基因，可能在葉片的生長發育中具有重要的功能。

2.6 編輯突變體的表達分析

將上述1#～4#T0代編輯突變體（即轉基因當代）獲得的種子進行種植，分別獲得T1代1#～4#的轉基因株系，通過檢測均獲得了純合編輯突變體。為了檢測編輯突變體中OsDUF393的轉錄水平，提取1#～4#T1代轉基因株系中純合突變體單株的葉片RNA并經反轉錄獲得cDNA。通過RT－PCR分析突變體中OsDUF393基因的表達水平，結果表明，目的基因在不同純合編輯突變體中轉錄水平均有下降，2#純合編輯突變體中表達量明顯降低，在3#純合編輯突變體中幾乎不表達（圖7－A、圖7－B），表明編輯突變體中OsDUF393的轉錄受到影響。2#和3#純合編輯突變體均為較大片段缺失突變體，可能對DNA序列及結構造成較大影響，目的基因OsDUF393轉錄水平受到影響較大。尤其3#突變體的41 bp堿基缺失是從目的基因的起始密碼子開始，可能對OsDUF393的起始轉錄造成了較大影響，致使3#株系純合編輯突變體不能檢測到該基因的表達。1#和4#純合編輯突變體為單堿基插入，可能對DNA序列及結構造成影響較小，因此目的基因OsDUF393轉錄水平受到的影響較小。

圖7 純合編輯突變體的表達檢測

3 討論與結論

未知功能結構域蛋白家族（DUFs）是一個有著眾多家族成員的蛋白家族，不同DUFs基因具有不同的生物學功能。DUF393家族屬于未知功能蛋白家族。一些研究初步表明，DUFs基因在逆境脅迫下誘導表達，參與了水稻對生物或非生物脅迫的響應。已報道Os－DUF500基因表達水平與水稻的白葉枯病抗性相關，利用RNAi技術敲降OsDUF500基因，在RNAi轉基因株系中發現水稻株高變矮、葉片變短，出現白色空秕谷，對白葉枯病菌的抗性增強[24]。DUF761家族基因OsLCL3受低溫強烈誘導，在低溫脅迫下，過表達轉基因植株的細胞膜表現出很強的穩定性，且存活率明顯高于對照組，上調OsLCL3基因的表達水平能夠增強植株的耐低溫能力[25]。作為DUF蛋白家族中的一員，目前尚未有關于該家族基因生物學功能的報道。DUF393家族基因成員存在于許多植物中，如水稻、擬南芥、大豆、玉米及高粱等植物中均含有此家族成員基因。不同DUF393蛋白家族成員在蛋白序列上相似性較高，在其N端均存在2個高度保守的半胱氨酸殘基。

本實驗為了揭示OsDUF393基因在水稻生長發育中的功能，利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯水稻基因OsDUF393，獲得了OsDUF393基因編輯突變體。實驗結果顯示，2個靶點均獲得了不同類型的編輯突變體。而且編輯突變體的轉錄水平受到明顯的影響，說明CRISPR/Cas9載體正常工作，可以獲得預期突變體。擬南芥中與OsDUF393高度同源的基因—AT5G50100，編碼1個DCC1蛋白，能夠通過氧化還原調控ROS穩態，從而調節擬南芥的芽再生過程。而活性氧又與大多數植物的抗逆應答反應息息相關。OsDUF393的組織特異性表達分析表明，該基因在葉片中特異性表達。我們推測OsDUF393基因可能與水稻的非生物脅迫應答反應相關，后續我們將對OsDUF393的不同T2代純合編輯突變體進行高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫處理，從而探究該基因的功能。并用GUS融合表達載體分析其啟動子活性及誘導表達；構建OsDUF393基因的GFP融合載體，探究該基因的亞細胞定位，精確研究該基因功能。