烏茲別克斯坦引進棉花種質資源抗旱性比較及相關分子標記篩選

葉春秀，趙曾強，田又升，王志軍，于 航，莊振剛，謝宗銘

(1.新疆農墾科學院/作物種植創新與基因資源利用兵團重點實驗室，新疆 石河子 832000；2.新疆農業大學，新疆 烏魯木齊 830000)

【研究意義】新疆屬于典型的灌溉農業，年降水量在200 mm以下，農業用水資源主要為雪山融水和地下水，水資源匱乏和利用水平低下成為新疆農業可持續發展的重要限制因子[1]。棉花是新疆重要的經濟作物之一。生物(病蟲害等)和非生物脅迫(干旱、低溫等)是新疆棉花生產穩定發展的主要限制因素。當前棉花育種的主要目標是早熟、抗逆、適宜機械采收，但限于現有種質資源和傳統育種手段，難以選育出適應當前生產急需的棉花品種。因此，迫切需要在種質資源和育種新技術方面有盡快突破。現代分子生物學技術的發展，特別是分子標記輔助選擇技術的日益成熟，為棉花育種提供了強有力手段。國外種質資源的引進和再創新利用是解決新疆棉花種質資源遺傳基礎狹窄和新品種選育的重要途徑。【前人研究進展】吾買爾江.庫爾班[1]等對收集引進的64份國外(美國46份、前蘇聯5份、澳大利亞12份、墨西哥1份)陸地棉材料進行連續3年的纖維品質穩定性及衣分變化規律的初步研究，表明在新疆南疆氣候條件下引進種質纖維長度、伸長率的穩定性比較好，其它纖維性狀不同程度地發生變化；衣分表現為逐年增高的趨勢，這些材料的收集和鑒定對新疆棉花育種工作具有重要的意義。Alisher Abdullaev[2]等詳細介紹說明了烏茲別克斯坦棉花種質資源收集歷史、過程及當前面臨的挑戰，為我國棉花種質資源工作者提供豐富的烏茲別克斯坦的棉花種質信息和收集情況。師維軍等[3]對收集引進的100份國外陸地棉種質資源材料在新疆特定生態條件下的主要農藝性狀、生物學性狀、纖維品質、抗病性、抗蟲性等方面的表現情況做了研究，篩選出一批具有一定利用價值的材料，促進新疆棉花種質資源及育種工作的開展。【本研究切入點】面對新疆棉花生產進一步發展的需要，從種質資源研究角度來說，一方面加強種質資源材料的收集引進工作，尤其是國外材料的收集引進具有重要意義，另一方面對引進種質在新疆地區適應性、抗逆性等方面進行鑒定對種質資源的評價和利用具有深遠意義。【擬解決的關鍵問題】本文通過對烏茲別克斯坦引進的種質資源進行抗旱性評價，并篩選相關的分子標記，為開展棉花多抗、宜機采種質資源創新和新品種選育奠定技術和基因資源基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗以從烏方引進棉花種質資源7份種質資源為研究材料，材料名稱分別為：引2、引4、引20、引23、引22(紅莖)、引22、引2(抗旱)。

1.2 試驗方法

實驗材料為水培培養，于材料長出6片真葉時采用PEG進行處理，分別采集處理0，2，4，6，8 d的葉片，錫箔紙包裝，液氮速凍保存，每份材料取樣3份用于后期生理生化指標測定。測定的生理生化指標包括SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)、CAT(過氧化氫酶)活性分析、MDA(丙二醛)含量、超氧陰離子含量、可溶性蛋白含量、APX(抗壞血酸過氧化物酶)等。其中SOD測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法測定[4]；POD采用愈創木酚法測定[5]；CAT活性參照田又升等[6-7]方法；MDA含量采用硫代巴比妥酸法[4]、超氧陰離子含量測定參照Elstner等[8]方法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定[9]。

1.3 抗旱分子標記篩選

通過查閱相關文獻，初步合成了8對抗旱性SSR標記，具體序列如表1。

由上海生工生物技術有限公司合成。PCR反應體系為20 μl，包含10×Buffer(含Mg2+)2.0 μl，dNTP 0.4 μl，引物2 μl，TaqDNA聚合酶0.2 μl (5 U/L)，模板DNA 2 μl，其余用ddH2O補充至20 μl。擴增程序為95 ℃預變性3 min，94 ℃變性50 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR反應在PCR儀中進行。擴增產物先在40 g/L的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，相機拍照、保存和計數1.4 數據分析。

實驗數據采用Excel 2013進行整理和作圖。

2 結果與分析

2.1 引進種質干旱處理POD、CAT活性變化趨勢

由圖1可以看出，所有種質在干旱處理后，POD活性都呈上升趨勢，但種質引4、引2(抗旱)、引22在干旱處理整個過程POD活性顯著高于其它4個種質，根據相關參考文獻初步推斷種質引4、引2(抗旱)、引22較其它種質耐旱。所有種質在干旱處理后，CAT活性變化趨勢存在差異，其中種質引4、引20、引23在整個干旱處理過程CAT活性變化呈先上升，后下降的波動趨勢；種質引22、引22(紅莖)、引2、引2(抗旱)CAT活性變化從處理2 d后幾乎都呈下降趨勢，根據相關參考文獻初步推斷種質引4、引20、引23較其它種質耐旱。

表1 引進種質抗旱性分子標記篩選引物序列

圖1 引進種質干旱處理POD、CAT活性變化趨勢Fig.1 The trend of POD and SOD activities

圖2 引進種質干旱處理MDA、超氧陰離子含量變化趨勢Fig.2 The trend of MDA and superoxide content

2.2 引進種質干旱處理MDA、超氧陰離子含量變化趨勢

由圖2可以看出，所有種質在干旱處理后，MDA含量變化趨勢在整個干旱處理過程中幾乎一致(先上升后下降)，不存在顯著的差異性。所有種質在干旱處理后，超氧陰離子含量變化趨勢存在差異，其中種質引4、引20、引22、引23超氧陰離子含量變化呈持續上升趨勢，直至處理8 d所有種質含量無明顯差異；而種質引22(紅莖)、引2、引2(抗旱)超氧陰離子含量變化在整個過程中呈持續下降的趨勢，根據相關參考文獻初步推斷，種質引4、引20、引22、引23較其它3份種質耐旱。

2.3 引進種質干旱處理可溶性蛋白含量、APX(抗壞血酸過氧化物酶)變化趨勢

由圖3可以看出，所有種質在干旱處理后，可溶性蛋白含量變化趨勢存在差異，其中種質引2、引4、引20、引23可溶性蛋白含量變化呈持續上升趨勢，直至處理8 d所有種質含量無明顯差異；而種質引22(紅莖)、引22、引2(抗旱)可溶性蛋白含量在整個過程中呈持續下降趨勢，根據相關參考文獻初步推斷，種質引2、引4、引20、引23較其它3份種質耐旱。

所有種質在干旱處理后，APX活性變化趨勢差異不明顯，其中只有種質引23的APX活性在處理2 d時急劇上升，為其它種質APX活性的4倍，而其它種質在干旱處理的整個過程APX活性變化趨勢幾乎一致，初步說明APX活性不能很好地作為鑒定引進種質抗旱性的指標。

圖3 引進種質干旱處理可溶性蛋白含量、APX(抗壞血酸過氧化物酶)變化趨勢圖Fig.3 The trend of APX and protein content

圖4 引進種質抗旱性相關標記篩選Fig.4 Molecular marker related to drought

2.4 引進材料的抗旱性相關分子標記篩選

通過篩選最終有2對引物在引進種質之間有差異條帶，將標記篩選結果與生理生化指標鑒定結果進行對比，發現引物B擴增結果與其具有一致性，其中耐旱種質引4、引20、引23、引22紅能夠得到與其它3份種質不同的擴增條帶(圖4)，多出1條擴增條帶，初步分析該引物可能是與耐旱性相關的標記。

3 討 論

棉花種質資源的收集、研究和利用收到世界各產棉國的高度重視，豐富的種質資源和遺傳多樣性是培育優良品種的必要條件，通過引進各類豐富的種質資源是拓展種質遺傳基礎的有效方法，同時對引進材料進行農藝性狀、抗逆性等方面的鑒定，可以為棉花育種提供豐富、有用的親本材料，加快育種進程[11-14]。張香桂等[15]為了有效利用引進的的棉花種質資源，對引進國外的154份種質材料進行主要農藝和經濟性狀研究，發現引進的材料類型較為豐富，具有選用矮桿、高籽指、高強纖維材料的潛力，同時具有較強的改良產量因素的潛力。劉少卿等[16]通過對引進的200份棉花種質耐熱性進行鑒定，篩選出了高溫耐熱性種質，用于育種和基礎研究中。朱竹青等[17]對來自中國、美國、法國等國家的114份棉花種質資源進行了生育、產量性狀、纖維品質及抗黃萎病、棉鈴蟲性鑒定，結果表明這些資源具有較強的生育性狀選擇潛力，篩選出一批具有不同優異性狀的種質材料，為棉花育種中有目的利用材料提供了參考。趙麗芬等[18]對引進巴基斯坦的54份棉花種質材料進行田間鑒定，結果表明引進的種質類型豐富，在抗高溫、抗病、改良纖維品質和提高產量等方面具有較高利用價值。

4 結 論

本研究通過對引進種質抗旱性相關指標的測定，推斷在引進的幾份種質中，種質引4、引20、引23耐旱性較強，種質引22稍弱，其它種質屬于干旱敏感型材料，能夠將結果用于實際育種過程中，同時抗旱相關分子標記的篩選能夠為分子標記輔助育種提供鑒定方法和應用。