不同生長年限白及的多糖組織化學定位研究

朱新焰，字淑慧，唐 宇，張智慧，楊竹雅，石亞娜，錢均祥，孫信梅，王家金，季鵬章*

(1.云南省農業科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650205；2.云南農業大學，云南 昆明 650201；3.云南中醫藥大學，云南 昆明 650500；4.彝良縣農業技術推廣中心，云南 彝良 657600)

【研究意義】白及[Bletillastriata(Thunb.) Reichb. f.]為蘭科白及屬多年生草本植物。現為《中國藥典》(2015年版) 收載的常用中藥[1]。白及具有理肺、止血消腫等功效，主要用于治療肺結核及咳血、吐血和外傷腫痛及胃潰瘍病等癥[2]。多糖是白及的主要有效成分，目前，白及以新鮮或干燥的假鱗莖入藥，葉、莖、根等部位則是棄而不用，造成了資源的嚴重浪費。同時，白及也是一種藥用價值高、需求量大、野生資源稀缺甚至瀕危，并且參偽十分嚴重的重要藥用植物。故白及植株的各器官值得深入研究，挖掘其有用部位，以減少資源和有效成分的浪費。【前人研究進展】組織化學定位技術在中藥材鑒定及化學成分分布特征和積累規律等方面研究有著重要用途[3-6]。對白及的研究主要集中在資源分布和假鱗莖多糖成分提取分離等方面[7-10]。目前，尚未見對白及和本屬植物多糖的組織化學定位的研究報道；而蘭科石斛屬植物的組織化學定位研究的報道則較多[11-12]。【本研究切入點】采用植物顯微的組織化學方法，研究不同生長年限白及的多糖分布積累特征，發掘白及各器官多糖蘊藏量，拓展資源利用范圍。【擬解決的關鍵問題】對白及多種器官進行多糖定性定量分析，揭示不同生長年限的藥材多糖分布場所和特征，為白及類藥用植物的葉、莖、根等部位的綜合開發利用提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

一年生、兩年生和三年生白及的根、假鱗莖、莖、葉均采自云南省農業科學院藥用植物研究所藥材種植基地。

1.2 藥品與儀器

鹽酸、高碘酸、品紅、亞硫酸氫鈉、甲醇、乙醇、偏重亞硫酸鈉等為分析純或試劑純試劑。主要儀器有：Nikon 80i顯微鏡，Nikon E100顯微鏡，FA1004電子分析天平等。

1.3 方法

1.3.1 染色試劑的配制 將堿性品紅溶于熱蒸餾水中，使之充分溶解，待溶液冷卻至50 ℃時過濾，再冷卻到25 ℃時加入鹽酸和亞硫酸氫鈉，放置暗處，靜置24 h后，加活性炭搖蕩，過濾后保存于冰箱中備用，呈淺黃色。

1.3.2 切片制作、固定 凈選不同生長年限白及的各器官進行徒手切片，選取細胞組織結構清晰、完整的切片染色。將組織切片用75 %乙醇溶液進行固定，比較不同固定時間后染色的效果。

1.3.3 染色 將選好的組織切片放入1.0 % HIO4水溶液中處理5～10 min后，用蒸餾水清洗3遍。再將不同方法固定的切片分別放入2種Schiff試劑內進行染色，設置染色時間梯度，選擇最適宜的染色時間進行實驗。染色結束以后，用偏重亞硫酸鈉溶液洗滌數次。制片在顯微鏡下進行觀察和拍照。

1.3.4 數據分析 隨機選取不同樣品的9～12張切片，在顯微鏡下進行觀察統計，各相同器官切片選取3個不同觀察視野；根據不同器官，觀察面積設為4×104～12×104μm2；統計分析各視野中的多糖數量，取平均值。根據細胞著色程度及顆粒物的多少和分布密度依次分為5個等級，從低到高分別用1個“+”到5個“+”表示。

2 結果與分析

2.1 多糖組織化學定位方法優化結果

2.1.1 固定時間 通過對切片用75 %乙醇溶液進行不同時間的固定后發現，25～30 min時間段內，固定效果較好，選取25 min對切片進行固定，條件優化結果見表1，圖1。

2.1.2 染色時間 不同染色時間的實驗結果顯示，染色25～40 min 時，細胞及組織著色較好，層次清晰，多糖物質顯示明顯。考慮到低年限生長白及的組織發育情況，所以選取染色時間為25 min，染色時間優化結果見表2，圖2。

a：固定20 min (40×)；b：固定25 min (40×)a: Fixed time of 20 min (40×); b: Fixed time of 25 min (40×)圖1 不同固定時間效果比較Fig.1 Comparison results of different fixed time

固定時間(min)Fixed time顆粒狀多糖數量Polysaccharide quantity固定時間(min)Fixed time顆粒狀多糖數量Polysaccharide quantity5+30+ + + + +15+ + +40+ + + +20+ + + +60+ +25+ + + + +120-

表2 染色時間的優化結果

2.2 白及根、假鱗莖、莖、葉內多糖的分布及定量分析

在不同年限的白及根中，多糖分布在維管束及皮層薄壁細胞中，并且這些部位細胞壁染色較深，其它位置有少量分布。3年生的根部多糖分布較多，1年生及2年生的較少，見表3、圖3。

在白及假鱗莖內，多糖主要在皮層薄壁組織、維管束及其鞘細胞中，多數呈顆粒狀或小團塊；皮層薄壁細胞、韌皮部、木質部及維管束鞘細胞的細胞壁、細胞質染色較深。該部位多糖數量隨生長年限的增多而升高，見表3、圖4。

白及莖中的多糖主要分布在皮層薄壁組織及細胞內、維管束及其鞘細胞的細胞壁和細胞質中，呈小顆粒狀，總體呈現分布較均勻，數量也有隨生長年限增加而升高的趨勢，見表3、圖5。

白及葉中多糖主要分布在葉肉細胞中，維管束及其鞘細胞也有分布。該部位多糖數量僅次于假鱗莖，多呈小團塊或顆粒狀；并且，顆粒隨著生長年限延長而增大。見表3、圖6。

結合生長年限及4種不同器官分析，含糖量最高的是假鱗莖，其次為葉片，根和莖最低。各器官多糖的數量范圍為觀察3個面積相同(12×104μm2)的不同視野的平均值；各圖展示的是該年限各器官的代表性的著色及多糖顯微特征，主要顯示的是多糖集中的薄壁細胞等組織。

a：染色15min (40×)；b：染色25 min (40×)a: Dyeing time of 15 min (40×); b: Dyeing time of 25 min (40×)圖2 不同染色時間效果比較Fig.2 Comparison results of different dyeing time

1：薄壁細胞；2：多糖；a：1年生根；b：2年生根；c：3年生根1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; a: The root of 1 year old; b: The root of 2 years old; c: The root of 3 years old圖3 白及根中多糖分布情況Fig.3 Distribution of polysaccharide in the roots of Bletilla striata

1：薄壁細胞；2：多糖；a：1年生假鱗莖；b：2年生假鱗莖；c：3年生假鱗莖1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; a: The pseudobulb of 1 year old; b: The pseudobulb of 2 years old; c: The pseudobulb of 3 years old圖4 白及假鱗莖中多糖分布情況Fig.4 Distribution of polysaccharide in the pseudobulbs of Bletilla striata

1：薄壁細胞；2：多糖；3：維管束；4：維管束鞘細胞；a：1年生莖；b：2年生莖；c：3年生莖1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; 3: Vascular bundles; 4:Bundle sheath cells; a: The stem of 1 year old; b: The stem of 2 years old; c: The stem of 3 years old圖5 白及莖中多糖分布情況Fig.5 Distribution of polysaccharide in the stems of Bletilla striata

1：薄壁細胞；2：多糖；a：1年生葉；b：2年生葉；c：3年生葉1: Parenchyma cells; 2: Polysaccharide; a: The leaf of 1 year old; b: The leaf of 2 years old; c: The leaf of 3 years old圖6 白及葉中多糖分布情況Fig.6 Distribution of polysaccharide in the leaves of Bletilla striata

Table 3 Quantitative analysis of polysaccharides in different tissues ofBletillastriata

生長年限Growth years多糖數量(個)Polysaccharide quantity根假鱗莖莖葉1年7～10280～4055～7143～1722年13～17433～48015～18180～2353年26～33520～56623～27268～310

3 討 論

通過對不同生長年限的白及根、假鱗莖、莖及葉的多糖組織化學定位定量分析，每種器官各觀察9～12張切片，在顯微鏡下進行觀察統計，各相同器官切片選取3個不同觀察視野區域發現，4種器官均有多糖分布，主要分布在皮層及薄壁細胞中，韌皮部及維管束鞘細胞等組織及細胞中也有分布，同時，這些組織的細胞壁、細胞質著色較深。在選育和栽培白及時，以假鱗莖等器官中薄壁細胞的數量多少作為一個重要指標，具有一定的指導意義[13]。將同一生長年限的白及各器官作比較，除一年生的根部多糖含量略高于莖外，4種器官多糖含量高低依次為：假鱗莖、葉片、莖、根。而將不同生長年限的同一器官相比較，假鱗莖、莖、葉的多糖含量均隨生長年限增加而升高。在實際使用中，選擇采收3年生白及的假鱗莖入藥是合理的。

實驗結果表明：白及葉、莖、根中均有多糖分布，特別是葉片多糖含量也很高；甚至部分樣品葉片與假鱗莖中多糖含量相近似。這可能與白及葉片表面積較大，在進行光合作用時合成了較多的糖類物質有關。另外，在白及的總生物量中，葉和莖占到30 %左右，但在白及的常規使用中，是將葉片等部位棄而不用。近年來，白及資源遭到過度采挖，導致野生資源瀕危；而白及需求量在逐年提高，使藥材價格不斷攀升，混偽品藥材充斥市場。因此在實際生產中要重視白及葉片的開發利用，尋找新的藥用部位，減少資源的浪費，提高白及資源的綜合利用效率。

4 結 論

不同生長年限和不同器官及組織中，白及多糖的含量差異顯著。組織化學定位方法可以揭示、分析白及多糖的分布場所和數量。多糖主要分布在皮層、韌皮部的薄壁細胞中，維管束中也有少量分布；以3年生白及的多糖含量最高。研究結果可為篩選高多糖的白及種質資源及其選育提供相關依據。不同器官中，白及葉片多糖數量僅次于假鱗莖。在視野觀察面積均為12×104μm2下，葉片含多糖最高平均數量(3年生)達268～310個，與假鱗莖(520～566個)相比，占其數量的51 %～54 %左右。因此，應加大對白及地上部分的發掘，特別要重視葉片的綜合開發與利用。研究結果可為尋找替代資源或新的藥用部位提供參考依據。