豬孤雌激活胚胎和卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的甲基化檢測(cè)

宋尚橋，曾素先，馬圍圍，王睿敏，嚴(yán) 瑾， 孫翠翠，李 鑫，黎宗強(qiáng)*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 南寧市江南區(qū)沙井街道辦事處水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站，廣西 南寧 530045)

【研究意義】DNA甲基化是調(diào)節(jié)核重編程的眾多重要因素之一，其與一系列生命過(guò)程不可分割，例如基因激活、細(xì)胞分化與發(fā)育、以及衰老等等。因此，對(duì)于DNA甲基化的探索成為近年來(lái)的熱點(diǎn)的研究話題。在近些年的研究報(bào)道中發(fā)現(xiàn)DNA甲基化異常現(xiàn)象存在于很多種動(dòng)物的體細(xì)胞克隆胚中[1-3]。開展豬孤雌激活胚胎甲基化水平的研究，有助于了解早期胚胎的基因組甲基化的進(jìn)程和發(fā)展，對(duì)于胚胎發(fā)育具體的機(jī)制的研究以及深度探討胚胎發(fā)育失敗的原因具有深遠(yuǎn)的影響和重要的意義。【前人研究進(jìn)展】DNA甲基化異常現(xiàn)象存在于很多種動(dòng)物的體細(xì)胞克隆胚中[1-3]。若想要將克隆有效的進(jìn)行下去，對(duì)于甲基化被反轉(zhuǎn)而又能重新被建立這方面是不可或缺的[4]，然而，對(duì)于甲基化的再一次形成以及去甲基化的具體機(jī)制尚不明確。有關(guān)報(bào)道表明，在發(fā)育成熟后的卵母細(xì)胞以及精細(xì)胞中存在多個(gè)CpG位點(diǎn)被甲基化，這個(gè)階段的甲基化水平雖然低于精子的甲基化成熟，但是，就總體而言，受精前配子的甲基化呈現(xiàn)出一個(gè)較高的水平[5]。而大范圍的脫甲基化是在胚胎植入前期進(jìn)行。如果在卵子成熟期，卵子的甲基化水平低或者是不正常，會(huì)引起受精卵的甲基化異常，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎的發(fā)育異常。目前普遍認(rèn)為為了使核再程序化進(jìn)行得更完全，MⅡ期卵母細(xì)胞質(zhì)是適宜的受體，而處于G0期或G1期的體細(xì)胞核是合適的核供體，檢測(cè)卵母細(xì)胞發(fā)育的情況為核移植，克隆等技術(shù)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，提高核移植和克隆等技術(shù)的效率。精子和卵子甲基化程度的差異被認(rèn)為是配子“印記”的可能機(jī)制。然而，超數(shù)排卵母豬的胚胎在合子時(shí)期，父本基因組在受精后迅速的發(fā)生去甲基化，而母本的基因組保持的高度的甲基化水平[6]。在兔子和羊的合子中用同樣的染色方法，卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類似的變化[7]。Kono KT等人[8]研究發(fā)現(xiàn)，父方的基因印記對(duì)于孤雌生殖的影響可能是主要的影響因素，而父方的染色體基因印機(jī)對(duì)后代的發(fā)育密切相關(guān)的這個(gè)嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)對(duì)單親哺乳動(dòng)物后代不能發(fā)育的定論是一個(gè)極大的沖擊，與此同時(shí)也說(shuō)明了哺乳動(dòng)物的發(fā)育與基因組保持正常的印記狀態(tài)之間是密不可分的。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)于孤雌胚胎印跡基因、卵母細(xì)胞成熟過(guò)程的基因組甲基化、胚胎細(xì)胞的凋亡、甲基化、端粒長(zhǎng)度的改變等方面的研究性報(bào)道較多，但是在卵母細(xì)胞的成熟以及孤雌激活胚胎方面還未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】根據(jù)對(duì)豬孤雌激活胚胎培養(yǎng)過(guò)程和豬卵母細(xì)胞體外成熟前后的DNA甲基化水平及其變化的檢測(cè)，為更好的探討豬孤雌激活胚胎和卵母細(xì)胞的發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 從廣西南寧市附近的屠宰場(chǎng)收集豬卵巢，并置于25 ℃的0.9 %生理鹽水中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用0.9 %生理鹽水沖洗3次。

1.1.2 主要試劑 所用化學(xué)試劑除特別指明外均購(gòu)自Sigma公司，如：離子霉素，6DMP；洗卵液(CCM)；胚胎培養(yǎng)液(NCSU)。培養(yǎng)用TCM-199購(gòu)自Gibco公司，鼠源抗5-甲基胞嘧啶單克隆抗體、FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自calbiochem公司，一次性塑料皿為NUNC公司產(chǎn)品。FSH和L H均為中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 成熟卵母細(xì)胞的收集 用注射器(帶針頭)在卵巢表面上抽取直徑為2～6 mm卵泡的卵母細(xì)胞，在顯微鏡的觀察下用玻璃吸管吸取胞質(zhì)呈均勻分布和2層卵丘細(xì)胞以上的卵母細(xì)胞選擇具有完整卵丘細(xì)胞層及均勻細(xì)胞質(zhì)的卵母細(xì)胞用CCM洗凈。

將卵母細(xì)胞以30～60枚為1組轉(zhuǎn)移至玻璃平皿(30 mm×10 mm)中，這個(gè)玻璃平皿含有1.5 mL成熟培養(yǎng)液，并將玻璃平皿放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的條件設(shè)定為38.5 ℃、5 % CO2和最大飽和濕度。

試驗(yàn)將細(xì)胞分為7組：未成熟卵母細(xì)胞甲基化檢測(cè)；體外成熟12 h卵母細(xì)胞甲基化檢測(cè)；體外成熟24 h卵母細(xì)胞甲基化檢測(cè)；體外成熟36 h卵母細(xì)胞甲基化檢測(cè)；體外成熟36 h有極體卵母細(xì)胞甲基化檢測(cè)；體外成熟48 h有極體卵母細(xì)胞甲基化檢測(cè)；體外成熟48無(wú)極體卵母細(xì)胞甲基化檢測(cè)。

1.2.2 豬卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 將卵母細(xì)胞以30～60枚為1組轉(zhuǎn)移至玻璃平皿(30 mm×10 mm)中，這個(gè)玻璃平皿含有1.5 mL成熟培養(yǎng)液，并將玻璃平皿放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的條件設(shè)定為38.5 ℃、5 % CO2和最大飽和濕度。

1.2.3 豬卵母細(xì)胞的孤雌激活 將豬卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)44～48 h后放入含0.1 %透明質(zhì)酸酶的洗卵液中，用200 μl的槍頭輕輕吹打震蕩并隨之將卵丘細(xì)胞清除，在40倍的體視顯微鏡下用肉眼觀察是否有卵母細(xì)胞排出第一極體，以排出第一極體作為卵母細(xì)胞核成熟的標(biāo)志，將核成熟卵母細(xì)胞挑選出來(lái)。在用2.5 mmol/L二甲氨基嘌呤處理4 h之前，先用5 μmol/L離子霉素處理5 min，最后再移到每滴100 μl的胚胎培養(yǎng)基中培養(yǎng)168 h。培養(yǎng)在含5 % CO2的空氣、最大飽和濕度的39 ℃培養(yǎng)箱。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡熒光半定量檢測(cè)[7]

(1)用0.3 %～0.5 %的鏈蛋白酶去除透明帶。

(2)4 %多聚甲醛室溫30 min。

(3)PBS液洗滌1～2次，0.5 % TritonX-100室溫處理20 min以增加細(xì)胞膜通透性。

(4)加入4M鹽酸處30 min使DNA變性。

(5)用100 mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.5)中10 min。

(6)PBS液洗滌3遍(每次靜置5 min)，在2 % BSA的PBS液中室溫封閉1 h以封閉抗體的非特異結(jié)合位點(diǎn)。

(7)分2組：一組為樣品陰性對(duì)照(直接加羊抗鼠FITC二抗孵育，避光，室溫，1 h)，剩余進(jìn)行以下免疫結(jié)合。

(8)200倍濃度的鼠源抗5-甲基胞嘧啶單克隆抗體中孵育，4 ℃冰箱中過(guò)夜保存。

(9)PBS液洗滌1～2次(每次靜置5 min)，加100倍濃度的羊抗鼠FITC二抗孵育，避光，室溫，1 h。

(10)PBS洗滌1～2次(每次靜置5 min)，封片；封片步驟：①將放在酒精中的載玻片和蓋玻片取出，用絲綢擦拭干凈；②在載玻片左側(cè)，與蓋玻片面積相當(dāng)大小4個(gè)角落，涂上4滴石蠟油以起到支撐作用，防止細(xì)胞被蓋玻片壓碎；③在4個(gè)石蠟油滴中央涂上20 μl封片劑；④取出洗凈的胚胎，每片10～15枚胚胎放入封片劑中央；⑤順時(shí)針撥動(dòng)位于封片劑的胚胎，使之均勻分布在4個(gè)石蠟油滴的中央?yún)^(qū)域；⑥待水分蒸發(fā)少許，輕輕蓋上蓋玻片，對(duì)角線輕壓蓋玻片，使細(xì)胞與蓋玻片、載玻片均有接觸，不要太用力，防止把細(xì)胞壓碎。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料分析用t檢驗(yàn)，P≤0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨后的圖像處理使用Photoshop 7.0 軟件[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中的甲基化檢測(cè)

用免疫熒光組織化學(xué)法對(duì)7組卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期各發(fā)育階段卵母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度均有差異，說(shuō)明在各個(gè)不同的時(shí)期以及不同的發(fā)育階段卵母細(xì)胞的核全基因組的DNA甲基化水平呈現(xiàn)出不同的差異(圖1)。

對(duì)上述免疫熒光組織化學(xué)法染色的卵母細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡熒光半定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬卵母細(xì)胞體外成熟階段的甲基化水平整體甲基化水平較高，這樣高的甲基化水平正是滿足豬卵母細(xì)胞在受精前所必備的條件。豬卵母細(xì)胞體外成熟階段的甲基化水平在整體水平上是一個(gè)逐漸上升的趨勢(shì)，但在36 h的卵母細(xì)胞體外成熟階段的甲基化水平達(dá)到一個(gè)峰值(表1)。

2.2 對(duì)孤雌激活胚胎體外培養(yǎng)過(guò)程中的甲基化檢測(cè)

用抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)抗體免疫熒光染色法對(duì)附植前的豬PA胚胎二細(xì)胞期、四細(xì)胞期、八細(xì)胞期、桑葚胚期和囊胚期進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞期的熒光強(qiáng)度不一樣，表明不同時(shí)期各發(fā)育階段卵母細(xì)胞的核全基因組DNA的甲基化平均水平不同。從八細(xì)胞期、桑葚胚期和囊胚期可以明顯觀察到在同一枚胚胎中，不同卵裂球的染色強(qiáng)度不同(圖2)。

圖1 豬卵母細(xì)胞體外成熟前后的DNA甲基化模式Fig.1 The DNA methylation pattern in pig before and after maturation oocyte

表1豬卵母細(xì)胞體外成熟前后發(fā)育過(guò)程中的單細(xì)胞核全基因組DNA甲基化變化

Table 1 Individual nuclei DNA methylation changes of the pig oocytes before and after maturation

卵母細(xì)胞成熟時(shí)間(h)Oocyte maturation time熒光量(x±SD)Total fluorescence03100±23123300±42243480±13363647±3336?3338±32483450±4848?3554±17

注：*為有極體。

Note：*means polar body.

對(duì)上述抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)抗體免疫熒光染色法染色的豬PA早期胚胎二細(xì)胞期、四細(xì)胞期、八細(xì)胞期、桑葚胚期和囊胚期進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡熒光半定量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)豬PA早期胚胎單細(xì)胞核全基因組DNA呈現(xiàn)出高度的甲基化。但從二細(xì)胞到囊胚期過(guò)程中，豬PA早期胚胎DNA甲基化水平由高到低，然后再升高的這樣一個(gè)波動(dòng)的變化，并在桑葚胚期出現(xiàn)一個(gè)谷值(表2)。

3 討 論

有研究結(jié)果表明，超排、體外受精以及培養(yǎng)條件的不同等的非自然操作會(huì)使得2-細(xì)胞胚胎的甲基化缺陷[12]。除此之外，從8-細(xì)胞到桑椹胚這個(gè)時(shí)間段的卵裂球細(xì)胞之間的甲基化水平的不同與發(fā)育至囊胚細(xì)胞譜系分化(即內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞)的相關(guān)性尚不明確，需要進(jìn)行深度的解析和探討。豬卵母細(xì)胞的體外成熟模擬卵母細(xì)胞在體內(nèi)的發(fā)育機(jī)制，營(yíng)造一個(gè)和體內(nèi)相似的環(huán)境，使其在體外發(fā)育成熟，為胚胎移植、孤雌激活和體外受精等方面提供了一定的理論基礎(chǔ)和研究思路。

表2 豬PA早期胚胎單細(xì)胞核全基因組DNA甲基化變化

本研究使用免疫熒光染色的方法對(duì)豬卵母細(xì)胞體外受精胚胎的全基因組甲基化模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)成熟前后的豬卵母基因組甲基化情況變化很大，分析可能是體外成熟的結(jié)果，即：卵母細(xì)胞從卵泡抽出來(lái)，進(jìn)入人工模擬的卵泡環(huán)境，導(dǎo)致甲基化水平升高。縱觀整個(gè)的豬卵母細(xì)胞體外成熟階段的甲基化水平，整體的高的，和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相類似[13]，這樣高的甲基化水平正是豬卵母細(xì)胞在受精前必備的條件。如果低的甲基化，或者是其他的非正常情況，可能會(huì)引起胚胎的發(fā)育不全或者是缺陷[14]。也只有接近于供體核的甲基化水平，才能擔(dān)當(dāng)作為受體的的重任。可見(jiàn)，豬卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)模式已經(jīng)趨于成熟。

將豬PA和牛IVF早期胚胎單細(xì)胞核全基因組DNA甲基化變化進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在孤雌激活胚胎的二細(xì)胞、四細(xì)胞、八細(xì)胞的細(xì)胞核都呈高度的甲基化，到桑葚胚(約有25個(gè)卵裂球)時(shí)期，總體的甲基化水平均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[7]。這種趨勢(shì)和豬體內(nèi)的早期胚胎基因組甲基化水平的變化是一致的[6]。和牛以及小鼠的相比較，也是大體一致的[7, 10]。這個(gè)去甲基化狀態(tài)是逐步的，被動(dòng)的和DNA復(fù)制依賴性的，與發(fā)生第1次DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，細(xì)胞核中維持DNA水平的酶Dnmtl缺失的結(jié)果[11]，主要發(fā)生在第2、3卵裂周期；當(dāng)發(fā)育到前原腸胚這個(gè)階段會(huì)出現(xiàn)一個(gè)關(guān)于重新甲基化的強(qiáng)烈的反應(yīng)，這會(huì)使得甲基化的水平慢慢的恢復(fù)。在此過(guò)程之中，除了CpG島的管家基因沒(méi)有參與這個(gè)過(guò)程之外，其余的全部基因都參與到了這個(gè)反應(yīng)的過(guò)程中。

圖2 附植前的豬PA胚胎的DNA甲基化模式Fig.2 The DNA methylation pattern in preimplantation pig PA embryos

目前，體外成熟[9]和體外培養(yǎng)[7, 15]等體外操作技術(shù)對(duì)于不同的配子或者是不同的胚胎都會(huì)有可能造成胚胎不同程度的甲基化的缺陷，其他的研究者對(duì)于檢測(cè)的牛IVF早期胚胎和豬PA胚胎均是由卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)、孤雌激活(PA)、體外受精(IVF)和受精卵體外培養(yǎng)(IVC)的方式獲得。激光共聚焦顯微鏡的靈敏度不夠高，不能發(fā)現(xiàn)單個(gè)基因和序列的甲基化變化情況，另外，亞硫酸鹽處理就可以精確到一個(gè)基因或者序列。但是，這些結(jié)果并不必然和全基因組的甲基化情況相符合[6]。

4 結(jié) 論

IVM/PA/IVC對(duì)豬卵母細(xì)胞及早期胚胎的甲基化模式有一定影響以及豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中，豬卵母細(xì)胞核基因組的甲基化水平接近于正常體內(nèi)的卵母細(xì)胞。