寨卡病毒NS1蛋白的原核表達和單克隆抗體的制備

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寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)是一種新發的蟲媒傳播病毒，屬于黃病毒屬成員，其基因組編碼3種結構蛋白(Capsid, prM/M, E)和7種非結構蛋白(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5)。ZIKV主要通過伊蚊主要是埃及伊蚊和白紋伊蚊叮咬傳播，也可通過母嬰傳播、血液傳播和性傳播[1]。2007年在西太平洋密克羅尼西亞的雅浦(Yap)島上發生了第一次ZIKV感染疫情[2]，2013年10月，在法屬波利尼西亞發生了大規模疫情[2-3]，之后，ZIKV在世界范圍內迅速蔓延，并在2015年，巴西的ZIKV感染已經達到了大規模流行的水平。ZIKV感染后80%的成年人幾乎沒有任何明顯癥狀，20%的成年患者有輕微的癥狀，通常表現為發熱、黃斑皮疹、關節痛、結膜炎、頭痛等[2]。但是，孕期感染ZIKV的母親產下的孩子會有小頭畸形[4]，此外，在ZIKV非常流行的哥倫比亞發現了大量的格林-巴利綜合征的患者[5]，這意味著ZIKV和這些神經障礙之間有很強的聯系。ZIKV感染已成為熱帶和亞熱帶地區的一個主要公共衛生問題，2016年起，ZIKV的流行已被世界衛生組織列為國際公共衛生緊急事件[6]。

目前沒有任何針對ZIKV感染的抗病毒藥物，預防感染的疫苗仍在臨床試驗階段[7]，因此，病毒感染的早期診斷在患者治療中顯得尤為重要。在常規的診斷方法中，使用RT-PCR、Real-time RT-PCR檢測病毒核酸具有較高的靈敏度和特異性，但是需要專門的實驗設備和經驗豐富的技術人員，并且由于核酸提取過程容易受酚類、鹽和乙醇等化學試劑殘留等影響而容易出現假陰性結果，實驗室內部核酸交叉污染也容易導致假陽性問題。聯合兩種或兩種以上的檢測方法對ZIKV感染的診斷更為準確，因此，發展ZIKV血清學檢測手段具有重要的意義。在使用RT-PCR方法檢測雅浦ZIKV感染病人血清的同時，Robert S. Lanciotti 等人分別使用ZIKV、登革熱病毒(DENV)1-4型、黃熱病病毒(YFV)、日本腦炎病毒(JEV)和墨累河谷腦炎病毒(MVEV)抗原包被捕獲血清IgM的ELISA方法檢測病人血清，發現ZIKV感染的病人血清IgM與登革病毒、日本腦炎病毒和黃熱病毒的抗原有交叉反應，這種交叉反應在第一次被黃病毒感染的病人中出現的機會較小，而在第二次被黃病毒感染的病人中出現的機會很大[8]。這種與其他黃病毒間的交叉反應性增加了使用ELISA法診斷ZIKV感染的難度，目前為止仍沒有開發出針對ZIKV的ELISA檢測試劑盒。

黃病毒NS1蛋白是7種非結構蛋白中唯一能分泌到感染病人血清中的非結構蛋白[9-10]，在病毒感染細胞后，NS1能夠以可溶的六聚體形式分泌出細胞外，在病毒感染早期即能夠在血清中檢測到NS1，因此，NS1可作為臨床快速診斷病毒早期感染的標志。已有研究顯示NS1蛋白中攜帶有較多的特異性表位，可以誘導出多個在黃病毒屬病毒中無交叉反應的特異性抗體[11]。本研究擬通過構建寨卡病毒NS1蛋白重組表達質粒、表達與純化NS1蛋白、小鼠免疫、細胞融合和抗體篩選等步驟制備針對寨卡病毒NS1蛋白的單克隆抗體，為后續建立針對NS1蛋白的ELISA檢測方法及相關研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1質粒和菌株、實驗動物和主要試劑 原核表達質粒pET-32a、ER2566菌株以及HB101菌株由本實驗室保存。BALB/C小鼠購自斯萊克景達實驗動物有限公司。GAM-IgG-HRP由廈門大學夏寧邵教授惠贈；限制性內切酶XhoI、XbaI以及DNA相對分子質量標準購自TaKaRa公司；抗His-tag鼠單克隆抗體、Ni-IDA Resin、質粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自上海生工公司；HT、HAT以及弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；DMEM培養基購自GIBCO公司；胎牛血清購自天杭生物科技有限公司；HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天能科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司。

1.2重組質粒的構建與鑒定 以研究較多的2007年雅浦島Zika流行株(GenBank No. AY632535)序列為模板，商業合成NS1基因序列，使用PCR的方法在NS1的N端引入6×His標簽。將ZIKV的NS1片段與表達載體pET32a經XhoI/XbaI雙酶切后，16 ℃連接1 h，轉化至大腸桿菌HB101中，挑取單菌落進行鑒定，將鑒定正確的質粒轉化至大腸桿菌表達菌ER2566中，挑取單菌落接種至3 mL LB液體培養基中，待OD600nm至0.6～0.8時，加入濃度為200 μg/mL的IPTG，誘導重組蛋白的表達，離心收集菌體,制備蛋白質樣品進行12%的SDS-PAGE電泳鑒定。

1.3ZIKV NS1蛋白的表達及純化 將重組表達菌株接種到1 L LB液體培養基中，待菌液OD600nm至0.6～0.8時，加入濃度為200 μg/mL的IPTG，誘導后離心收菌并超聲破碎，懸液、上清和沉淀分別取樣，12%的SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達方式。用2%的TritonX-100 (buffer I) 和buffer I洗滌沉淀，然后用8 mol/L尿素溶液重懸，4 ℃梯度透析復性，當透析至2 mol/L Urea (PBS) 后，用鎳柱親和層析法對收集的蛋白進行純化。分別用含2 mol/L尿素的不同濃度的咪唑進行梯度洗脫，分別收集流穿液和洗脫液，將洗脫液用1 mol/L Urea(PBS)、PBS梯度透析復性，12% SDS-PAGE 鑒定蛋白純度。

以10倍柱床體積的磷酸Buffer預先平衡TSK-GEL G3000 SW分子篩層析柱至280 nm處的吸收值的波動小于0.001，把透析復性后的樣品先用0.22 μm的濾膜過濾，接著以0.5 mL/min的流速過柱，收集280 nm處吸收值大于0.2 AU的蛋白峰。制備蛋白質樣品進行12% SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

將純化后的重組NS1蛋白進行12%的SDS-PAGE電泳，300 mA恒流電轉60 min，用5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，以鼠源His-tag單抗作為一抗，4 ℃孵育過夜，以GAM-IgG-HRP作為二抗，室溫孵育1 h，配制新鮮的ECL工作液，滴加到膜上后顯影。

1.4小鼠免疫 將純化后的蛋白按1∶1的比例與弗氏完全佐劑充分乳化后，皮下多點免疫6～8周齡的BALB/c小鼠，劑量為100 μg/只。兩周后，與弗氏不完全佐劑充分乳化，然后以同樣的劑量和方法對小鼠進行兩次加強免疫，每次間隔兩周。在細胞融合前3d，對小鼠進行脾臟加強免疫，劑量為100 μg/只。每次免疫前1d對小鼠進行眼球靜脈取血，間接ELISA檢測免疫小鼠效價。將純化的NS1蛋白用蛋白包被液稀釋至濃度為1 μg/mL后包被于聚苯乙烯板條上，ED封閉，用小鼠血清作為一抗，濃度從1∶100梯度稀釋至1∶400 000，HRP標記羊抗鼠IgG(1∶10 000)作為二抗，TBST洗板，TMB底物顯色，2 mol/L H2SO4終止顯色反應，450 nm/630 nm雙波長檢測各孔的OD450nm值，將小鼠免疫前的血清作為陰性對照，以大于2.1倍陰性值作為陽性。

1.5細胞融合 脾臟免疫后3 d，取免疫小鼠的脾臟，收集脾細胞，再收集生長狀態良好的SP2/6骨髓瘤細胞，將SP2/6與脾細胞按1∶5～1∶10進行混合，在37 ℃預熱的聚乙二醇(PEG)1500作用下進行細胞融合，并用無血清DMEM培養基終止融合。用20% FBS-HAT-DMEM培養基懸浮細胞，然后均勻鋪于96孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.6雜交瘤細胞的篩選及克隆化 融合后的細胞在培養第7 d左右用10% FBS-HT-DMEM培養基半量換液，待細胞集落長至孔底面積的1/3～1/2時，取培養上清，用間接ELISA方法進行檢測，以細胞培養上清作為一抗，選取OD450nm值較高且細胞集落數目少的孔，通過有限稀釋法進行克隆化。進行3～4次克隆化，直至細胞培養上清陽性率達100%。取細胞上清作為一抗，分別以抗 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM的抗體作為二抗，使用間接ELISA法對單克隆抗體進行亞型鑒定。

1.7單克隆抗體的制備、純化和鑒定 取8～10周齡的雄性BALB/c小鼠，按每只500 μL的劑量腹腔注射石蠟油。7 d后用PBS將雜交瘤細胞數調整為1×106～2×106個/mL，按每只500 μL的劑量腹腔注射小鼠。7～10 d后，收集腹水，將腹水通過辛酸-飽和硫酸銨沉淀和Protein G柱進行純化，將純化前后的腹水抗體進行12% SDS-PAGE鑒定。將純化后的重組NS1蛋白進行12% SDS-PAGE，以制備的單克隆抗體作為一抗，以GAM-IgG-HRP作為二抗，對單克隆抗體進行鑒定。

1.8單克隆抗體的效價測定 使用間接ELISA法測定抗體效價，用單克隆抗體作為一抗，濃度從1∶1 600梯度稀釋至1∶1 280 000，將OD450nm值大于陰性對照2.1倍的檢測孔的最低抗體濃度定為抗體效價。

2 結 果

2.1ZIKV NS1原核表達質粒的構建及重組NS1蛋白的表達與純化 以化學合成的ZIKV(GenBank No. AY632535)序列為模板擴增NS1基因，通過XhoI/XbaI雙酶切將NS1基因插入pET32a原核表達質粒中，將重組NS1-pET32a質粒轉化至表達菌株，經IPTG誘導后，SDS-PAGE檢測蛋白表達情況，結果顯示：與對照組相比，誘導后的重組菌株表達了一個大小約30 kD的蛋白(圖1A)。重組NS1蛋白含有358個氨基酸，大小約40 kD，為了驗證誘導后表達蛋白是否為NS1蛋白，我們以抗His標簽抗體作為一抗，使用Western blot對重組蛋白的表達情況進行鑒定，結果顯示，在30 kD處經IPTG誘導的重組菌株出現了特異性條帶，而對照菌株中沒有出現(圖1B)，說明表達菌株經IPTG誘導后所表達蛋白為帶有His標簽的NS1重組蛋白，重組蛋白電泳比預期分子量小，可能是由于蛋白電泳速率差異，或者是重組NS1在菌體中出現部分片段降解所導致的。超聲破碎經IPTG誘導的重組表達菌株，SDS-PAGE結果顯示，與其他黃病毒NS1蛋白原核表達一致[12]，ZIKV NS1蛋白也主要以包涵體的形式表達(圖1C)。我們將包涵體用尿素溶解后透析復性，并經His-taq親和層析純化后，繼續對其進行分子篩層析，并用Western Blot鑒定，結果顯示：經分子篩層析純化后的蛋白純度高，達到免疫小鼠制備單克隆抗體的要求(圖1D、E)。

(A)SDS-PAGE、(B)Western Blot鑒定重組NS1的表達(M：預染蛋白質相對分子質量標準；1：未加IPTG的對照菌株表達的蛋白；2：加IPTG誘導的重組菌株表達的蛋白)。(C)SDS-PAGE鑒定重組NS1的表達方式(M：預染蛋白質相對分子質量標準；1：超聲破碎后懸液；2：離心后上清；3：離心后沉淀)。(D)SDS-PAGE鑒定分子篩純化后的重組蛋白純度(M：預染蛋白質相對分子質量標準；1：分子篩純化后的重組NS1蛋白)。(E)Western Blot鑒定分子篩純化后的重組蛋白純度。黑色箭頭所指為目的蛋白。

2.2間接ELISA檢測免疫小鼠的效價 以純化后的NS1蛋白作為抗原免疫小鼠，使用間接ELISA法檢測血清中抗體效價，結果顯示：小鼠在初次免疫后抗體水平較低，在第2次和第3次加強免疫以后，小鼠血清抗體含量明顯升高，效價可達1∶100 000 (圖2)，說明重組NS1蛋白在小鼠體內能引起較強的免疫反應，其作為抗原具有良好的免疫原性，3次免疫后血清效價達到制備單克隆抗體的要求。

圖2 間接 ELISA 檢測小鼠血清抗體效價Fig.2 Antibody titers of mice sera detected by indirect ELISA

2.3細胞融合、抗重組NS1單克隆抗體的篩選及亞型鑒定 將小鼠脾細胞取出與骨髓瘤細胞進行融合，用間接ELISA方法進行陽性克隆的檢測，然后通過有限稀釋法對OD450nm值較高且細胞集落數目少的孔進行克隆化(圖3)，通過4次克隆化，篩選出了3株選能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為6B8、7D11、3E2。將雜交瘤細胞的培養上清進行亞型鑒定，結果顯示：6B8、7D11、3E2亞型均為IgG1型。

圖3 單克隆抗體的亞型鑒定Fig.3 Subtype identification of anti-NS1 monoclonal antibodies

2.4單克隆抗體的純化與鑒定 收集注射雜交瘤細胞的小鼠腹水，使用辛酸-飽和硫酸銨沉淀和Protein G柱純化單克隆抗體，將純化前后的腹水抗體進行12% SDS-PAGE電泳，結果顯示：純化后的抗體出現了3條帶：50 kD的重鏈、25 kD的輕鏈和大小約100 kD的條帶。煮沸后50 kD的重鏈條帶明顯變強，100 kD的條帶變弱，25 kD的輕鏈煮沸前后條帶強弱相差不大(圖4A)。100 kD的條帶為重鏈與重鏈的聚合體，是由于兩條重鏈間的二硫鍵沒有完全破壞所形成。凝膠圖上雜蛋白條帶很少，說明純化后的單克隆抗體達到了很高的純度，可以用于后續實驗。Western Blot結果顯示：三株抗體與重組蛋白反應后出現單一條帶(圖4B、C、D)，說明篩選的3株單抗能夠特異識別重組NS1蛋白。使用間接ELISA法測定純化后的單克隆抗體的效價，結果顯示：6B8的效價可達到1∶51 200，7D11的效價為1∶3 200，3E2的效價最高，可達到1∶640 000(圖4E)。

(A)SDS-PAGE鑒定純化后的單克隆抗體(M：預染蛋白質相對分子質量標準；1：腹水(稀釋10倍)；2：辛酸沉淀純化；3：未煮沸的50%硫酸銨沉淀純化；4：煮沸的50%硫酸銨沉淀純化；5：未煮沸的純化后單克隆抗體；6：煮沸的純化后單克隆抗體)。(B)Western Blot鑒定3E2。(C)Western Blot鑒定6B8。(D)Western Blot鑒定7D11。(E)單克隆抗體的效價測定。

3 討 論

ZIKV屬于黃病毒屬成員，同屬的JEV、DENV、YFV等病毒均在我國流行，因此ZIKV也有在我國有大規模暴發的可能。目前沒有任何針對ZIKV的抗病毒藥物，預防的疫苗仍在臨床試驗階段[7]，早期診斷可以為患者節省寶貴的時間，因此，在邊境口岸建立ZIKV快速檢測技術，進行ZIKV的現場篩查和檢測就顯得尤為重要。

本研究中，誘導表達的溫度和誘導時間都是至關重要的。溫度過低，由于酶活性降低導致生物大分子合成速度變慢，不利于高效表達重組蛋白；而溫度過高，蛋白雖然能大量表達，但不利于其形成正確的空間構象。本實驗中將重組表達菌在16 ℃誘導8 h后發現，重組蛋白表達量低，與誘導前無明顯差別。而當誘導條件改為37 ℃誘導4 h后，經收集菌體、超聲破碎細胞發現，重組蛋白大量表達，并主要以包涵體的形式存在。包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒。而尿素是一種變性劑，可以使蛋白變性，從而變成可溶的形態。對包涵體進行洗滌，在溶解包涵體時發現2 mol/L和4 mol/L尿素不能溶解重組蛋白，而8 mol/L尿素可以溶解大部分的重組蛋白。本研究采用透析復性來恢復蛋白質的生物活性，先將蛋白濃度調節至0.1～1 mg/mL，因濃度太高容易形成聚體沉淀，濃度太低不經濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩定，容易變性。然后在4 ℃條件下，每隔3 h梯度稀釋透析液，當透析至1 mol/L尿素時，有大量蛋白發生沉積，目的蛋白回收率很低，因此當透析至2 mol/L尿素后，先用鎳柱親和層析法對收集的蛋白進行純化，即用含2 mol/L尿素的不同濃度的咪唑進行梯度洗脫，分別收集流穿液和洗脫液，然后將洗脫液用1 mol/L尿素、PBS梯度透析復性，在透析過程中，只有少量蛋白發生了沉積現象，目的蛋白的回收率較高。本研究在動物免疫時選取了弗式佐劑以及皮下注射的免疫策略，通過對細胞融合這一關鍵步驟的把握，保證了較好的陽性克隆率。融合后至細胞生長到孔底面積的1/3～1/2時進行亞克隆，避免發生陽性細胞漏檢和染色體丟失的情況。采用操作簡便的有限稀釋法，確保了雜交瘤細胞系的穩定性和抗體分泌效價高的特點。經過4次克隆化，使獲得的雜交瘤細胞培養上清陽性率達100%，得到的雜交瘤細胞株能穩定、高效的分泌抗NS1蛋白的單克隆抗體，為后續建立針對NS1蛋白的ELISA檢測方法及相關研究提供了基礎。