ASE-CAD結(jié)合柱后補(bǔ)償液相色譜法測(cè)定浙貝母中貝母素甲和貝母素乙

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 南寧 530000

浙貝母為百合科植物浙貝母FritillariathunbergiiMiq．的干燥鱗莖，具有清熱化痰止咳，解毒散結(jié)消癰的作用[1]。其有效成分主要為生物堿，其中又以貝母素甲和貝母素乙為主[2]。文獻(xiàn)顯示其含量測(cè)定主要是采用含有毒性大的三氯甲烷溶液提取，然后采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法測(cè)定[1-3]，此類方法較成熟但前處理普遍耗時(shí)較長。前處理使用的ASE是一種在高溫高壓條件下萃取樣品中有機(jī)組分的新方法，其通過維持體系內(nèi)的高壓狀態(tài)使得溶劑在高溫條件下不汽化，具有自動(dòng)化，提取效率高等特點(diǎn)。電霧式檢測(cè)器(Charged Aerosol Detector，CAD)是在2004年才推出的一種較為新型的通用型檢測(cè)器，其響應(yīng)值不依賴于被測(cè)物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)和離子化效率能檢測(cè)非揮發(fā)或很多半揮發(fā)性的物質(zhì)。研究表明，與ELSD比較，CAD 具有更高的檢測(cè)靈敏度[4-5]和更加均勻一致的響應(yīng)因子[6]，在中藥或天然藥物中的皂苷或膽酸等缺少紫外發(fā)色團(tuán)的成分分析中應(yīng)用較多[7-8]。柱后補(bǔ)償(反梯度)即在色譜柱后進(jìn)入檢測(cè)器前加入另一分析溶劑，通過增加有機(jī)相比例，可以提高霧化效率，增加響應(yīng)值，降低檢出限，提高檢測(cè)效果[9]。本研究采用快速溶劑萃取法提取浙貝母中貝母素甲和貝母素乙，并結(jié)合HPLC-CAD法進(jìn)行分離測(cè)定。在實(shí)驗(yàn)中采用梯度洗脫與柱后補(bǔ)償進(jìn)行分析，進(jìn)一步提高了貝母素甲和貝母素乙響應(yīng)因子的一致性。本方法不僅操作簡便、準(zhǔn)確度高，而且ASE法提取時(shí)間僅為常規(guī)方法的1/8，能滿足浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的快速測(cè)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 XA205DU電子分析天平、ASE350快速溶劑萃取儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)、Ultimate3000雙三元高速液相色譜儀(含CAD檢測(cè)器，美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 材料 對(duì)照品貝母素甲(批號(hào)：110750-201311，含量按97.3%計(jì))、貝母素乙(批號(hào)：110751-201611,含量按96.4%計(jì))均購自中國生物制品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)用藥品均購自當(dāng)?shù)厮幏?浙貝母產(chǎn)地浙江，批號(hào)：1510111、150827、150618；產(chǎn)地江西，批號(hào)151102)；水為純化水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定貝母素甲對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含貝母素甲1.4710 mg；精密稱定貝母素乙對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含貝母素乙1.4225 mg，作為對(duì)照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號(hào)篩)約1 g，精密稱定，與適量硅藻土混合均勻填充于10 mL萃取池，按快速溶劑萃取儀優(yōu)化的條件進(jìn)行提取，萃取溶劑為75%乙醇、萃取溫度80 ℃、靜態(tài)萃取時(shí)間3 min、循環(huán)萃取2次、沖洗體積60%、吹掃時(shí)間100 s，萃取結(jié)束后，將萃取液置蒸發(fā)皿中蒸至近干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2 ASE萃取條件的優(yōu)化 利用單因素依次考察了萃取溫度(80 ℃、90 ℃、100 ℃)，靜態(tài)萃取時(shí)間(3、5、10 min)、循環(huán)次數(shù)(1次、2次、3次)。結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明結(jié)果不同的溫度和不同的萃取時(shí)間下貝母素甲和貝母素乙的總量沒有明顯差異；循環(huán)次數(shù)升到2次以后，總量即沒有明顯增加。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3 min，提取次數(shù)2次，沖洗體積60 %，吹掃時(shí)間100 s。

2.3 色譜條件 色譜柱：ACE Excel C18-AR(2.1×50 mm，1.7 μm)；分析泵(右泵)流動(dòng)相：乙腈-0.1%氨水，梯度洗脫：0 ～1 min，40%～40%乙腈，1～5 min，40%～60%乙腈，平衡時(shí)間為4 min；柱溫：40 ℃；流速0.3 mL/min；電噴霧檢測(cè)器(CAD)檢測(cè)，CAD霧化器溫度為45 ℃；進(jìn)樣量5 μL。補(bǔ)償泵(左泵)流動(dòng)相：乙腈-水，啟用Chromeleon 7工作站中的“反梯度”功能，設(shè)定延遲時(shí)間為0.5 min，流速0.3 mL/min，補(bǔ)償泵流動(dòng)相與分析泵流動(dòng)相在色譜柱后三通相接，混合后進(jìn)入電霧式檢測(cè)器進(jìn)行定量分析，霧化器溫度50 ℃，柱溫箱溫度35 ℃，進(jìn)樣量3μL，理論塔板數(shù)按貝母素甲計(jì)不低于4000，結(jié)果見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密移取“2.1”項(xiàng)下貝母素甲對(duì)照品溶液(1.4710 mg/mL)、貝母素乙對(duì)照品溶液(1.4225 mg/mL)各0.2、0.5、1、2、4 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。按照2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，以質(zhì)量濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸。求得貝母素甲回歸方程：Y= 23.3914X+0.5806，r= 0.9992，在0.0294～0.5884 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。求得貝母素乙回歸方程：Y= 23.5288X+0.5429，r= 0.9991，在0.0284～0.5690 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果貝母素甲和貝母素乙峰面積RSD分別為0.5%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：150827)各6份，每份 1 g，按“2. 1. 2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2. 3”項(xiàng)下色譜條件平行試驗(yàn)，結(jié)果貝母素甲和貝母素乙的平均含量分別為0.673 mg/g和0.453 mg/g，RSD分別為2.5%和2.1%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、16 h依法測(cè)定。結(jié)果貝母素甲和貝母素乙對(duì)照峰面積的RSD為1.5%、1.6%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已測(cè)定的同批號(hào)樣品(批號(hào)為150827)9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入貝母素甲與貝母素乙貯備液0.1、0.2、0.3 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果貝母素甲三個(gè)水平的平均回收率在97.23%～100.90%之間，RSD為1.89%；貝母素乙三個(gè)水平的平均回收率在96.32%～98.75%之間，RSD為1.39%。

2.9 樣品的測(cè)定 取各批次樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表1，結(jié)果表明，藥典方法與ASE方法結(jié)果RAD在0.8%～3.4%之間，兩個(gè)方法間差異不大，但ASE方法實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)僅20 min，在效率上有很大優(yōu)勢(shì)。

表1 方法含量對(duì)比

3 討論

實(shí)驗(yàn)采用快速溶劑萃取法提取浙貝母中貝母素甲和貝母素乙與藥典方法對(duì)比，其前處理時(shí)間僅為藥典的1/8，在效率上有較大的提升，另外在實(shí)驗(yàn)操作上釋放了人力，降低了人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中采用柱后補(bǔ)償技術(shù)進(jìn)行有機(jī)相補(bǔ)償，提高了重現(xiàn)性及響應(yīng)因子的一致性，可用于在缺少對(duì)照品的情況下，作為貝母素甲和貝母素乙的相對(duì)測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)建立了快速溶劑萃取-柱后補(bǔ)償液相色譜結(jié)合電霧式檢測(cè)器分析浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的含量測(cè)定方法。經(jīng)過線性、穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度和加樣回收等方法學(xué)考察，結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度高，精密度、重復(fù)性較好，可作為浙貝母中母素甲和貝母素乙的含量測(cè)定方法。