豆粕多肽鋅螯合物的抗氧化性研究

(徐州工程學(xué)院 食品(生物)工程學(xué)院， 江蘇 徐州 221018)

多肽是涉及生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)，它具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能和為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)的雙重功效[1]。鋅是人體必需的微量元素之一，具有重要的生理功能和營(yíng)養(yǎng)作用[2]。

螯合物的生物學(xué)利用率高于無(wú)機(jī)金屬鹽，且無(wú)毒副作用，能有效提高其吸收率[3]。多肽-金屬離子螯合物的研究始于20世紀(jì) 60 年代[4]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)學(xué)者也有一些研究報(bào)道，如高素蘊(yùn)[5]以中性蛋白酶水解豆粕得到的多肽與鋅鹽絡(luò)合制備了多肽絡(luò)合鋅，初步研究了其抗氧化作用，結(jié)果表明脫脂豆粕多肽絡(luò)合鋅對(duì)豬油具有抑制自動(dòng)氧化的作用。李文軍等[6]采用不同方法研究了多肽金屬螯合物的抗氧化功能，結(jié)果表明其對(duì)過(guò)氧化物的生成有一定的抑制作用，對(duì)氧自由基和雙氧水均有很強(qiáng)的消除作用，證明了金屬螯合物具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

本實(shí)驗(yàn)考察了大豆多肽鋅離子螯合物的體外抗氧化性能，有著十分重要的研究意義和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆粕：徐州農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；三氯乙酸、正丁醇、三氯化鐵、蒽酮、鐵氰化鉀、2-硫代巴比妥酸、卵磷脂(大豆)：均為分析純。

7230G型可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DL-5低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；THZ-C恒溫振蕩器 江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司。

1.2 豆粕多肽的提取

酶解溫度37 ℃，準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g胰蛋白酶、3 g豆粕于三角瓶中，加入水，調(diào)節(jié)pH至8.3，置于恒溫振蕩器中反應(yīng)2 h，將酶解液離心，取上清液在100 ℃的沸水中滅酶3 min，離心分離，干燥，待用。

1.3 豆粕多肽與鋅離子螯合

采用靜態(tài)法，在自然pH值、30 ℃、150 r/min條件下，鋅離子的初始濃度為5 mg/mL，多肽與鋅離子的比值為6∶1，螯合4 h，螯合率為94.82%，螯合后鋅離子的濃度為0.2592 mg/mL，螯合率計(jì)算見(jiàn)下式：

螯合率=(C0-C)/C0×100%。

式中：C0表示吸附前溶液中鋅離子的濃度(mg/mL)，C表示吸附后溶液中鋅離子的濃度(mg/mL)。

1.4 抗氧化性能研究

1.4.1 清除羥基自由基(·OH)的活性

參考顏軍等[7]的實(shí)驗(yàn)方法，采用Fenion反應(yīng)法。

·OH清除率=(A0-Ax)/A0×100%。

式中：A0表示空白對(duì)照液的吸光度；Ax表示加入樣品液的吸光度。

1.4.2 清除DPPH·的活性

參考鄭善元等[8]的實(shí)驗(yàn)方法，采用二苯代苦味肼基自由基(DPPH·) 分光光度法。

DPPH·清除率=(A1-A2)/A1×100%。

式中：A1表示空白吸收值(t=0 min)；A2表示DPPH與樣液反應(yīng)30 min后的吸光度。

1.4.3 還原力的測(cè)定

參考聶凌鴻等[9]的實(shí)驗(yàn)方法，采用鐵氰化鉀法。

還原力=(A1-A0)/A0×100%。

式中：A1表示加入提取液的吸光度；A0表示空白對(duì)照的吸光度。

1.4.4 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物的抑制作用

參考張婭芳[10]的實(shí)驗(yàn)方法，采用硫代巴比妥酸(TBA)分光光度法。

抑制率=(A對(duì)照管-A樣品管)/A對(duì)照管×100%。

式中：A對(duì)照管表示對(duì)照管的吸光度；A樣品管表示樣品管的吸光度。

1.4.5 對(duì)亞硝酸鹽的清除能力

參考余勃[11]的實(shí)驗(yàn)方法，采用鹽酸萘乙二胺法。

亞硝酸鈉清除率=(A空白-A樣品)/A空白×100%。

式中：A空白表示空白管的吸光度；A樣品表示樣品管的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥基自由基(·OH)的清除能力

羥基自由基是已知最活潑的活性氧自由基，是危害最大的氧自由基，也是引起人體疾病和衰老的主要因素[12]。

圖1 豆粕多肽及鋅螯合物對(duì)·OH的清除作用Fig.1 Scavenging effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on ·OH

由圖1可知，多肽與鋅離子螯合前后對(duì)·OH都有一定的清除作用，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，清除率有所上升，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。多肽清除率的線性方程：y=22.25x+36.271(R2=0.9189)；多肽鋅離子螯合物清除率的線性方程：y=35.321x+40.9(R2=0.9278)；茶多酚清除率的線性方程：y=55.25x+37.357(R2=0.9278)，螯合后與螯合前的半數(shù)清除率分別為0.19和0.1028，螯合后的清除能力提高了28.86%，但均低于茶多酚。

2.2 DPPH·的清除能力

當(dāng) DPPH·與抗氧化劑混合反應(yīng)時(shí)，DPPH·的紫色會(huì)隨著抗氧化劑量的增加而消退變淺，主要是由于抗氧化劑提供電子和質(zhì)子傳遞給DPPH·，生成了顏色較淺的穩(wěn)定分子態(tài)的DPPH，故 DPPH·清除率取決于抗氧化劑供電子或質(zhì)子能力。

由圖2可知，多肽與鋅離子螯合前后對(duì)DPPH·都有一定的清除作用，隨著濃度的增加，清除率有所上升，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。多肽清除率的線性方程：y=40.786x+35.957(R2=0.9364)；多肽鋅離子螯合物與清除率的線性方程：y=78.75x+40.986(R2=0.9479)；茶多酚清除率的線性方程：y=71.857x+41.2(R2=0.9764)。螯合后與螯合前的半數(shù)清除率分別為0.869和0.566，螯合后的多肽清除能力比螯合前提高了34.87%，與茶多酚相當(dāng)。

圖2 豆粕多肽及鋅螯合物對(duì)DPPH·的清除作用Fig.2 Scavenging effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on DPPH·

2.3 還原力的測(cè)定

氧化還原反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)最普遍的生化過(guò)程，人體可以通過(guò)攝入抗氧化活性物質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。總還原力是抗氧化物質(zhì)提供電子能力的重要指標(biāo)之一，測(cè)定總還原力可以衡量其抗氧化能力[13]。

由圖3可知，多肽與鋅離子螯合前后都有一定的還原作用，隨著濃度的增加，還原力有所上升，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。多肽還原力的線性方程：y=2.6768x+0.7456(R2=0.93)；多肽鋅離子螯合物還原力的線性方程：y=2.9057x+1.0531(R2=0.9097)；茶多酚還原力的線性方程：y=2.9393x+0.6043(R2=0.9511)。螯合后與螯合前的半數(shù)清除率分別為0.19和0.1028，螯合后的豆粕多肽的還原能力比螯合前提高了45.89%，略低于茶多酚。

圖3 豆粕多肽及鋅螯合物的還原作用Fig.3 Reduction effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate

2.4 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物的抑制作用

油脂發(fā)生氧化酸敗最終形成過(guò)氧化物丙二醛，油脂中添加抗氧化劑，可使油脂的氧化酸敗過(guò)程受到阻止或延緩，生成的丙二醛含量就會(huì)降低，脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成量也會(huì)被抑制而減少[14]。

圖4 豆粕多肽及鋅螯合物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on lipid peroxides

由圖4可知，多肽與鋅離子螯合前后對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物都有一定的抑制作用，隨著濃度的增加，抑制率有所上升，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。多肽抑制率的線性方程：y=37.571x+28.843(R2=0.9674)；多肽鋅離子螯合物抑制率的線性方程：y=56.5x+30.843(R2=0.9164)；茶多酚抑制率的線性方程：y=46.107x+29.529(R2=0.9534)。螯合后與螯合前的半數(shù)清除率分別為0.784和0.537，螯合后的豆粕多肽抑制能力比螯合前提高了31.5%，且高于茶多酚14.63%。

2.5 對(duì)亞硝酸鈉的清除能力

人體每天通過(guò)食物和飲水都會(huì)攝入一些亞硝酸鹽，極其微量的亞硝酸鹽對(duì)人體的危害可忽略，但是在食品來(lái)源和生產(chǎn)環(huán)節(jié)，都可能會(huì)直接或者間接地增加亞硝酸鹽在食品中的含量，對(duì)人體造成急性或者慢性危害[15]。

圖5 豆粕多肽及鋅螯合物對(duì)亞硝酸鈉的清除作用Fig.5 Scavenging effect of soybean meal polypeptide and zinc chelate on sodium nitrite

由圖5可知，多肽與鋅離子螯合前后對(duì)亞硝酸鹽都有一定的清除作用，隨著濃度的增加，清除率有所上升，均呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。多肽清除率的線性方程：y=9.6071x+46.229(R2=0.9278)；多肽鋅離子螯合物清除率的線性方程：y=21.143x+46.257(R2=0.7919)；茶多酚清除率的線性方程：y=12.893x+44.943(R2=0.8619)。螯合后與螯合前的半數(shù)清除率分別為4.66和2.67，螯合后的豆粕多肽清除能力比螯合前提高了42.71%，且高于茶多酚22.61%。

2.6 抗氧化能力的對(duì)比

通過(guò)對(duì)比圖6中豆粕多肽、豆粕多肽鋅螯合物及茶多酚對(duì)·OH、DPPH·、脂質(zhì)過(guò)氧化物及亞硝酸鹽的半數(shù)抑制清除率，可知豆粕多肽與鋅離子螯合前后均具有一定的抗氧化能力，且清除羥基自由基的能力最強(qiáng)，清除亞硝酸鹽的能力最差；清除羥基自由基與DPPH自由基的能力略強(qiáng)于茶多酚，脂質(zhì)過(guò)氧化物的抑制能力與亞硝酸鹽的清除能力均低于茶多酚；豆粕多肽與鋅離子螯合后其抗氧化能力均有所提高。

圖6 豆粕多肽、豆粕多肽鋅螯合物及茶多酚抗氧化能力的比較Fig.6 Comparison of antioxidant ability of soybean meal polypeptide,soybean meal polypeptide and zinc chelate and tea polyphenol

3 結(jié)論

豆粕多肽對(duì)·OH、DPPH·、脂質(zhì)過(guò)氧化物、亞硝酸鹽都具有一定的清除和抑制能力，IC50值分別為0.19，0.869，0.784，4.66 mg/mL，具有一定還原能力；而鋅離子螯合后的多肽對(duì)上述自由基的清除或抑制能力都有所增加，IC50值分別提高了28.86%，34.87%，31.5%，42.71%，還原力比螯合前增加了45.89%，且清除羥基自由基的能力最強(qiáng)，清除亞硝酸鹽的能力最差；清除羥基自由基與DPPH自由基的能力略強(qiáng)于茶多酚，脂質(zhì)過(guò)氧化物的抑制能力與亞硝酸鹽的清除能力均低于茶多酚。

綜上所述，多肽與鋅離子螯合后比單純的豆粕多肽的抗氧化性能有較大提高，還可以成為微量元素的補(bǔ)充劑，為豆粕的開(kāi)發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。