納豆菌拮抗黃曲霉試驗(yàn)方法的研究

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(福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350119)

黃曲霉容易產(chǎn)生黃曲霉毒素，該毒素是一種有劇毒和強(qiáng)致癌物質(zhì)，為迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。黃曲霉毒素最易污染玉米、花生、花生油、大米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麥、高粱和甘薯[1]。黃曲霉毒素的裂解溫度為280 ℃，一般烹調(diào)加工溫度不足以將其破壞，而且在水中溶解[2]。因?yàn)橛衩椎燃Z食霉變而引起的動(dòng)物飼料霉變而產(chǎn)生毒素，引起畜產(chǎn)品毒素超標(biāo)[3]。因此，對(duì)黃曲霉毒素的控制重在避免食物或畜禽飼料污染黃曲霉而發(fā)生霉變。

近年來(lái)，對(duì)納豆菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的研究較多[4-12]。一般的研究方法主要是得到液體培養(yǎng)的細(xì)菌離心上清液，然后對(duì)其抑菌特性進(jìn)行考察，比較常用的方法主要是濾紙片法、牛津杯法等，但是，對(duì)于考察抑菌性能的試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，這些方法顯得有些繁瑣，而且真正需要通過(guò)這些試驗(yàn)方法得到試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，經(jīng)常碰到試驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定的情況。因此，探索穩(wěn)定、簡(jiǎn)便的試驗(yàn)方法具有重要意義。

本研究考察了納豆菌對(duì)常見(jiàn)的污染食品的黃曲霉的拮抗作用，并探討了方便、穩(wěn)定、操作性強(qiáng)的細(xì)菌抑制霉菌的試驗(yàn)方法，旨在為天然防腐劑的研究及開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

納豆菌、黃曲霉：由福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)訓(xùn)室提供；土豆、牙簽：市售。

1.1.2 試劑

瓊脂：BR生物試劑，杭州百思生物技術(shù)有限公司；葡萄糖：分析純，西隴化工股份有限公司。

1.1.3 儀器

DNP-9272BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HZ-HG-502N型電子天平 福州衡之展電子有限公司；LDZX-40AI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HH-4型恒溫水浴鍋 常州市凱航儀器有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基配方及配制方法[13]

1.1.4.1 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基配方

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1000 mL，pH值自然。

1.1.4.2 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基的配制方法

將馬鈴薯去皮，切成0.5 cm3的小塊，放入1000 mL水中，煮沸20～30 min，然后用4層紗布過(guò)濾得濾液，加入葡萄糖溶解后加入瓊脂煮沸，補(bǔ)充水至1000 mL，滅菌條件：121 ℃蒸汽滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 濾紙片法

將溶化的PDA培養(yǎng)基15～20 mL倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成平板，將活化2次的黃曲霉，用9 mL無(wú)菌生理鹽水，加入2環(huán)黃曲霉孢子，混勻待用；用無(wú)菌吸管取黃曲霉孢子懸液0.2 mL涂布平板；納豆菌用接種環(huán)挑取1環(huán)加入9 mL無(wú)菌生理鹽水混勻，將滅過(guò)菌的直徑為1 cm的圓形濾紙片蘸取已經(jīng)制備好的納豆菌液，并在試管壁上稍?？?，勿使濾紙上有過(guò)多菌懸液，貼在涂布黃曲霉24 h的平板上，每個(gè)濾紙片之間、濾紙片和培養(yǎng)皿邊緣之間間隔1 cm。

1.2.2 點(diǎn)值法

將溶化的PDA培養(yǎng)基15～20 mL倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中制成平板，將活化2次的黃曲霉，用9 mL無(wú)菌生理鹽水，加入2環(huán)黃曲霉孢子，混勻待用；用無(wú)菌吸管取黃曲霉孢子懸液0.2 mL涂布平板；納豆菌用滅菌牙簽蘸取平板上的納豆菌1次，在涂布黃曲霉的平板上連續(xù)點(diǎn)種4次，接種點(diǎn)之間和培養(yǎng)皿邊緣要間隔1 cm以上。

1.2.3 抑菌圈大小的測(cè)量方法

抑菌圈外邊緣直徑-納豆菌外邊緣直徑=抑菌圈的大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 濾紙片法

2.1.1 涂布黃曲霉后直接貼納豆菌懸液濾紙片

涂布黃曲霉孢子懸液后，直接貼納豆菌懸液濾紙片，納豆菌迅速長(zhǎng)滿整個(gè)平板，抑制黃曲霉生長(zhǎng)，導(dǎo)致黃曲霉無(wú)法萌發(fā)生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 涂布黃曲霉后0 h接種納豆菌的生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of Bacillus natto after coating Aspergillus flavus for 0 hour

由圖1可知，涂布黃曲霉孢子懸液和粘貼納豆菌懸液的濾紙片同時(shí)進(jìn)行，這種方法無(wú)法得到預(yù)想的結(jié)果。原因主要是平板中涂布黃曲霉孢子懸液后，培養(yǎng)基表面有較多水，蘸取納豆菌懸液的濾紙片在培養(yǎng)基表面容易滑動(dòng)，同時(shí)納豆菌有鞭毛，會(huì)運(yùn)動(dòng)，特別是培養(yǎng)基表面有水，更有助于納豆菌的運(yùn)動(dòng)，同時(shí)納豆菌的生長(zhǎng)繁殖速度比黃曲霉孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)速度快，加上納豆菌對(duì)黃曲霉有抑制作用，所以會(huì)出現(xiàn)納豆菌鋪滿整個(gè)平板而黃曲霉不長(zhǎng)的現(xiàn)象，由此可知該方法不可行。

2.1.2 涂布黃曲霉24 h貼納豆菌懸液濾紙片

涂布黃曲霉孢子懸液24 h，于長(zhǎng)有黃曲霉的平板表面貼納豆菌懸液的濾紙片，濾紙片貼好后正置培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，見(jiàn)圖2。

圖2 納豆菌生長(zhǎng)24 h的拮抗情況Fig.2 Antagonistic effect of Bacillus natto growing for 24 h

由圖2可知，黃曲霉孢子萌發(fā)，同時(shí)納豆菌產(chǎn)生明顯的抑菌圈。進(jìn)一步培養(yǎng)，納豆菌接種72 h后，二者的拮抗情況見(jiàn)圖3。

由圖3可知，沒(méi)有納豆菌抑菌物質(zhì)的地方，黃曲霉鋪滿整個(gè)平板并形成大量孢子，納豆菌的抑菌圈更加明顯而且抑菌物質(zhì)效果穩(wěn)定。由此可知，黃曲霉孢子懸液涂布平板后，28 ℃正置培養(yǎng)24 h，表面的水分充分蒸發(fā)，平面上沒(méi)有冷凝水，而且黃曲霉孢子已經(jīng)萌發(fā)，這時(shí)蘸取納豆菌菌懸液的濾紙片貼在平面上，納豆菌的運(yùn)動(dòng)受到限制，只能在固定的區(qū)域生長(zhǎng)繁殖，納豆菌生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，在菌生長(zhǎng)的地方和一定范圍內(nèi)抑制黃曲霉的生長(zhǎng)，產(chǎn)生明顯的抑菌圈。因此，該方法進(jìn)行拮抗試驗(yàn)是可行的。

圖3 納豆菌生長(zhǎng)72 h的拮抗情況Fig.3 Antagonistic effect of Bacillus natto growing for 72 h

2.1.3 涂布黃曲霉48 h貼納豆菌懸液濾紙片

涂布黃曲霉孢子懸液48 h，于長(zhǎng)有黃曲霉的平板表面貼納豆菌懸液的濾紙片，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，見(jiàn)圖4。

圖4 納豆菌生長(zhǎng)24 h的情況Fig.4 The situation of Bacillus natto growing for 24 h

由圖4可知，黃曲霉接種48 h，黃曲霉菌絲已經(jīng)長(zhǎng)出，鋪滿整個(gè)平板，這時(shí)將蘸取納豆菌懸液的濾紙片貼上去，紙片不能直接和培養(yǎng)基接觸，而且黃曲霉生長(zhǎng)已經(jīng)占有優(yōu)勢(shì)，納豆菌接觸不到培養(yǎng)基，無(wú)法生長(zhǎng)，所以無(wú)法產(chǎn)生抑菌現(xiàn)象。

2.2 點(diǎn)值法

涂布黃曲霉孢子懸液后，直接貼納豆菌懸液濾紙片，納豆菌迅速長(zhǎng)滿整個(gè)平板，抑制黃曲霉生長(zhǎng)，導(dǎo)致黃曲霉無(wú)法萌發(fā)生長(zhǎng)，無(wú)法得到預(yù)想的試驗(yàn)結(jié)果，因此此方法不可行。

根據(jù)濾紙片法的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，點(diǎn)值法的試驗(yàn)方法根據(jù)2.2進(jìn)行，傾倒PDA培養(yǎng)基15～20 mL，凝固形成平面，涂布黃曲霉孢子懸液0.2 mL，28 ℃正置培養(yǎng)24 h，用滅菌牙簽直接挑取納豆菌，在平板上點(diǎn)植，每個(gè)接種點(diǎn)之間、接種點(diǎn)和平皿邊緣分別間隔1 cm，28 ℃正置培養(yǎng)24 h，此時(shí)2種菌都能生長(zhǎng)，但是納豆菌周圍抑菌圈不明顯，結(jié)果見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 正面生長(zhǎng)情況(黃曲霉48 h，納豆菌24 h)Fig.5 The frontal growth situation (Aspergillus flavusgrows for 48 h, Bacillus natto grows for 24 h)

圖6 背面生長(zhǎng)情況(黃曲霉48 h，納豆菌24 h)Fig.6 The back growth situation (Aspergillus flavus grows for 48 h, Bacillus natto grows for 24 h)

繼續(xù)培養(yǎng)24 h觀察發(fā)現(xiàn)，納豆菌周圍出現(xiàn)明顯的抑菌圈，黃曲霉形成大量孢子，見(jiàn)圖7和圖8。

圖5基本未出現(xiàn)抑菌圈，圖7出現(xiàn)明顯的抑菌圈，繼續(xù)培養(yǎng)至納豆菌生長(zhǎng)60 h(見(jiàn)圖9)的抑菌圈大小和圖7基本一致，可以判斷納豆菌的抑菌物質(zhì)是菌體生長(zhǎng)到一定階段或時(shí)間后形成的。因此，納豆菌的抑菌能力與培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短有重要關(guān)系。

圖7 正面生長(zhǎng)情況(黃曲霉72 h，納豆菌48 h)Fig.7 The frontal growth situation (Aspergillus flavus grows for 72 h, Bacillus natto grows for 48 h)

圖8 背面生長(zhǎng)情況(黃曲霉72 h，納豆菌48 h)Fig.8 The back growth situation (Aspergillus flavus grows for 72 h, Bacillus natto grows for 48 h)

圖9 正面生長(zhǎng)情況(黃曲霉84 h，納豆菌60 h)Fig.9 The frontal growth situation (Aspergillus flavus grows for 84 h, Bacillus natto grows for 60 h)

2.3 濾紙片法和點(diǎn)值法抑菌圈的對(duì)比

濾紙片法和點(diǎn)值法的抑菌圈大小不再發(fā)生變化時(shí)，分別測(cè)量菌落及其周圍抑菌圈的垂直直徑，并計(jì)算納豆菌抑菌圈的大小，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 2種方法納豆菌抑菌物質(zhì)活性對(duì)比Table 1 Comparison of antimicrobial activity of Bacillus natto by two methods

注：φ表示菌落直徑；σ表示抑菌圈直徑；σ-φ表示抑菌圈大小。抑菌圈測(cè)試方法：先測(cè)菌落的直徑，再測(cè)抑菌圈的直徑。抑菌圈直徑-菌落直徑=抑菌圈大小，用抑菌圈的大小反映菌株分泌抑菌物質(zhì)能力的大小。

由表1可知，單從菌落直徑和抑菌圈直徑來(lái)看，濾紙片法明顯比點(diǎn)值法大，而且濾紙片的菌落直徑和抑菌圈直徑4平行數(shù)據(jù)比較均勻，而點(diǎn)值法的這些數(shù)據(jù)有些波動(dòng)，但是濾紙片法和點(diǎn)值法的抑菌圈大小平均值分別為11.3 mm和11.0 mm，差異并不明顯。2種方法均可行，通過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)值法較簡(jiǎn)單，重復(fù)性和穩(wěn)定性更好。菌落直徑和抑菌圈直徑大小波動(dòng)主要是點(diǎn)植時(shí)接菌量的多少造成的，從最后結(jié)果來(lái)看，通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)求平均值的方法及控制點(diǎn)植時(shí)的接菌量就能獲得波動(dòng)較小的結(jié)果。

3 結(jié)論

先在平板上涂布黃曲霉孢子懸液，再接種納豆菌，二者間隔時(shí)間不同，出現(xiàn)不同的拮抗效果。試驗(yàn)表明：最佳接種納豆菌的時(shí)間為黃曲霉涂布平板后24 h左右，此時(shí)平板表面沒(méi)有多余水分，納豆菌雖然有鞭毛，但是在沒(méi)有冷凝水的固體培養(yǎng)基表面運(yùn)動(dòng)受到限制，不容易出現(xiàn)片狀生長(zhǎng)，而且黃曲霉孢子已經(jīng)萌發(fā)，2種菌能夠同步生長(zhǎng)，從而達(dá)到理想的拮抗效果。

濾紙片法因?yàn)橛脠A形濾紙片蘸取納豆菌懸液，濾紙片上有大量水分，納豆菌有鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，生長(zhǎng)繁殖快，操作需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，否則容易出現(xiàn)失敗的結(jié)果。

點(diǎn)值法只需將納豆菌活化，在平板上出現(xiàn)單菌落，用滅菌牙簽蘸取納豆菌點(diǎn)種在涂布黃曲霉孢子懸液正置培養(yǎng)24 h左右的平板上，該方法操作簡(jiǎn)單，容易成功。

以上2種方法進(jìn)行抑菌效果的對(duì)比，雖然菌落和抑菌圈直徑出現(xiàn)較大差異，但是對(duì)比抑菌圈大小，數(shù)據(jù)顯示并無(wú)明顯差異。因此，進(jìn)行拮抗試驗(yàn)時(shí)選用點(diǎn)值法容易成功，簡(jiǎn)便易行，重復(fù)性和穩(wěn)定性好，容易得到理想的結(jié)果。