響應面分析法優化廣西北部灣南美白對蝦蝦頭酶解工藝

，，,3，*

(1.欽州學院，廣西 欽州 535099；2.廣西大學，南寧 530004；3.廣西北部灣特色海產品資源開發與高值化利用高校重點實驗室，廣西 欽州 535099)

南美白對蝦(Penaeusvannamei)學名凡納繽對蝦[1]，在我國廣東、廣西、海南等省產業帶迅猛發展，在“十一五”期間，在北海、欽州、防城港三市已形成南美白對蝦養殖優勢產業帶。我國對蝦市場近年容量可達200萬噸[2]，對蝦加工一般是去頭或去殼[3]，將產生諸多蝦廢棄物[4]，科學地利用蝦頭資源、提高其經濟價值是一種發展趨勢。張愛軍等[5]和Ifuku[6]利用蝦廢棄物制備甲殼素；Coward-Kelly等[7]利用蝦廢棄物制成飼料；Sánchez-Camargo等[8]利用蝦廢棄物提取蝦青素等；Robertoe等[9]和Amado等[10]利用蝦副產物提取蝦青素蛋白；但廣西蝦頭利用的研究報道較少且未見對酶種進行篩選后優化的報道。酶法是綠色環保技術，是具有一定催化活性位點的蛋白酶作用于蛋白質的肽鍵發生水解，使蛋白質斷裂成低分子量多肽[11,12]。故本試驗研究了最適酶種，根據Box-Behnken中心組合試驗確定最優酶解工藝條件并建立模型，為制備風味良好的南美白對蝦蝦頭調味料基料，打開廣西對蝦加工產生的大量廢棄物深利用的局面，增加廣西對蝦的經濟價值奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

南美白對蝦：廣西欽州市東風市場；木瓜蛋白酶(6×104U/g)、堿性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(2×105U/g)：南寧東恒華道生物科技有限責任公司；甲醛：上海化學試劑采購供應站經銷。

101-3型電熱鼓風恒溫干燥箱 上海東星建材試驗設備有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；EL204型電子天平 上海光譜儀器有限公司；EL20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 南美白對蝦蝦頭酶解工藝

蝦頭→清洗→晾干→打漿→加水混合→調pH、加酶→恒溫水解→滅酶→離心→酶解液。

1.2.2 測定方法

水分的測定：直接干燥法[13]；灰分的測定：高溫灼燒法[14]；粗脂肪的測定：索氏提取法[15]；蛋白質含量的測定：半微量凱氏定氮法[16]。

游離氨基氮的測定：甲醛電位滴定法[17]；將離心的酶解液加入到燒杯中，備用。加入10 mL中性甲醛，攪勻，靜置2 min，用0.5 mol/L的NaOH標準滴定溶液滴定至pH 9.2；并記錄消耗的0.5 mol/L NaOH標準液的毫升數V1。用相同體積蒸餾水重復上述操作進行空白測試。

游離氨基氮(mg/mL)=C×(V1-V2)×14/V。

公式(1)

式中：C為NaOH標準滴定液濃度；V1為消耗的標準滴定液的毫升數；V2為空白測試消耗標準滴定液的毫升數；V為上清液體積，mL。

蛋白質水解度(DH)=(離心所得氨基氮的質量)/樣品中總氮質量×100%[18]。

公式(2)

1.2.3 酶的篩選

選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種蛋白酶為實驗酶，根據選擇的蛋白酶的特性[19]和姜震、高翔等研究報道的蛋白酶的最適水解條件[20,21]，在酶活力相當的基礎上，分別用3種蛋白酶對南美白對蝦蝦頭進行酶解，酶解條件見表1。

表1 酶種酶解條件Table 1 Enzyme hydrolysis conditions

1.2.4 單因素試驗

采用1.2.1的工藝進行酶解單因素試驗，取蝦頭漿5.0 g，按加酶量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，料液比1∶2，溫度50 ℃，反應時間2 h，pH 7.0，考察加酶量對蝦頭水解度的影響；取蝦頭漿5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，溫度50 ℃，反應時間2 h，考察pH對蝦頭水解度的影響；取蝦頭漿5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，溫度50 ℃，pH 7.0，分別反應1，2，3，4，5 h，考察酶解時間對蝦頭水解度的影響；取蝦頭漿5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，pH 7.0，分別在30，40，50，60，70 ℃保溫2 h，考察酶解溫度對蝦頭水解度的影響。

1.2.5 Box-Behnken中心組合試驗

在單因素基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理[22]，以水解度為指標，進行響應面試驗設計，見表2。

表2 響應面設計表Table 2 Response surface design table

1.2.6 數據處理

用Design-Expert 8.0.5b軟件和Origin 8.0軟件處理試驗所得數據。

2 結果與分析

2.1 南美白對蝦蝦頭營養成分

表3 蝦頭營養成分Table 3 Nutritional components of shrimp head %

由表3可知，廣西北部灣地區南美白對蝦蝦頭營養成分依次為水分>粗蛋白>灰分>粗脂肪，蝦頭營養豐富，尤其是粗蛋白含量高達6.92%+0.01%，與張祥剛等[23]研究的陽江市誼林海達速凍水產有限公司提供的蝦頭營養成分相一致，其蛋白含量略高于廣西南美白對蝦，可能是地域、養殖方式和喂養方式不同等因素導致營養成分出現差異[24]。故充分利用蝦頭中的蛋白質，變廢為寶，提高蝦頭利用率[25]。

2.2 酶的篩選

圖1 酶種對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme species on the degree of hydrolysis

由圖1可知，在最佳酶解條件下，酶種對南美白對蝦蝦頭酶解有顯著影響。其酶解大小依次為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。相比中性蛋白酶，堿性蛋白酶的酶解能力提高了30%，而對于木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶的酶解能力提高了5%。可能是堿性蛋白酶為內切酶，屬于一種絲氨酸脆外高堿性蛋白酶，它能水解蛋白質分子肽鏈生產多肽或氨基酸，具有較強的分解蛋白質的能力[26]，比其他蛋白酶對南美白對蝦的酶解作用強。因此，確定了本試驗最佳蛋白酶是堿性蛋白酶。與姜震等采用酶解法提取龍蝦廢棄物中蛋白質所選的酶解蛋白酶相一致。

2.3 加酶量對水解度的影響

由圖2可知，隨著堿性蛋白酶用量不斷增加，水解度有顯著升高，加酶量達0.8%時，水解度達到最高，為38.07%，隨著加酶量增多，水解度降低。從酶促動力學的角度看，當酶用量加到一定值后會發生酶抑制作用，故水解度不會繼續升高。因此，選取加酶量為0.8%。

圖2 加酶量對水解度的影響Fig.2 Effect of the additive amount of enzyme on the degree of hydrolysis

2.4 pH對水解度的影響

圖3 pH對水解度的影響Fig.3 Effect of pH on the degree of hydrolysis

由圖3可知pH對蝦頭水解度的影響，pH達到8.0前，水解度隨pH增大而增大，pH 8.0時水解度達到最高，為38.38%，相比于起始pH 5.0，水解度提升了17%。之后隨pH值增高，水解度下降，可能是堿性蛋白酶最佳pH為8.0左右，此時有利于堿性蛋白酶對蝦頭蛋白進行水解，導致氨基氮含量有所變化。

2.5 時間對水解度的影響

由圖4可知，在1～3 h之間，隨著酶解時間增加，酶解效果越來越好，水解度逐漸增高。繼續延長酶解時間，水解度先下降然后趨于平穩，可能是隨著時間的增長，即加熱時間增長導致酶可能失活，酶活力下降。因此，選擇水解度最高的3 h。

圖4 時間對水解度的影響Fig.4 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.6 溫度對水解度的影響

圖5 溫度對水解度的影響Fig.5 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

由圖5可知，在選定的溫度范圍內，隨著溫度的升高，水解度也有顯著的增加，但在50 ℃以后，水解度開始降低，原因可能是加熱溫度過高使堿性蛋白酶失活，會抑制酶解反應的速率，導致水解度降低[27]。因此，選取溫度為50 ℃。

2.7 響應面優化試驗結果

為獲取風味好、水解率高的南美白對蝦蛋白酶解產物，在堿性蛋白酶水解單因素試驗的基礎上，利用響應面優化法進行最適水解條件的優化，響應面試驗數據見表4。

表4響應面試驗結果
Table 4 The results of response surface test

試驗號A加酶量(%)B pHC時間(h)D溫度(℃)水解度(%)11.07.03.05039.9720.88.04.06039.2330.88.03.05042.9641.08.04.05041.2951.08.03.06040.0860.88.03.05042.6270.87.04.05039.99

續 表

2.8 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.05b軟件對表4的27組試驗數據根據方程進行多元回歸分析，建立響應面回歸模型，得到水解度(DH)對編碼自變量A，B，C，D的標準回歸方程為：

方程1：DH=42.67+0.68A+0.67B+2.51C+4.23D+0.11AB-0.097AC-0.42AD-1.25BC-1.19BD-0.81CD-1.34A2-2.63B2-3.02C2-5.60D2。

轉化為實際空間的方程為：

方程2：DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D+0.53750AB-0.48750AC-0.21125AD-1.25000BC-0.11875BD-0.080750CD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。

方程3：DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D-1.25000BC-0.11875BD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression model and analysis of variance

注：p值<0.0001時表示極顯著，p值<0.0500時表示顯著；“**”表示極顯著，“*”表示顯著。

2.9 響應面圖分析

(a)加酶量與pH

(b) 加酶量與時間

(c) 加酶量與溫度

(d) pH與時間

(e)pH與溫度

(f) 時間與溫度

響應曲面的分析主要是從響應面曲線圖及等高線進行分析。由圖6中(a)可知，當時間為3 h時，酶解溫度為50 ℃，加酶量相對較少時，隨著pH值的升高，水解度增加效果只有微少變化；而當加酶量逐漸升高時，pH在零水平下的水解效果更好。由于單因素對響應面的影響是顯著的，當加酶量和pH值在接近零水平時，即加酶量在0.8%和pH值在7.8～8.2之間時，水解度出現最高點。由圖6中(b)可知，當pH值為8.0時，酶解溫度為50 ℃，在設定的范圍內，蝦頭水解度隨加酶量的增加而升高，同理，水解度也隨時間的延長在一定程度上升高。前期的試驗也證明，當加酶量和時間在接近零水平時，即加酶量為0.8%和酶解時間為3 h左右，水解度出現最高點。當pH值為8.0，時間為3 h，由于單因素對響應面影響顯著，在設定范圍內，水解度隨著加酶量的增加和溫度的提高而有一定的升高，當加酶量和溫度在接近零水平時，即加酶量為0.8%和溫度為50 ℃時，水解度出現最高值。當加酶量為0.8%，酶解溫度為50 ℃，pH值和時間以及它們的相互作用對水解度的影響都是顯著的，因為等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，越趨向于橢圓形以及相應曲面越陡峭表示兩因素交互作用顯著。pH值和時間在接近零水平，即當pH為8.0和酶解時間為3 h左右時，水解度出現最高值。由圖6中(e)可知，當加酶量為0.8%，酶解時間為3 h，pH和溫度以及它們之間的交互作用對響應面的影響都是顯著的，因為等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，越趨向于橢圓形以及相應曲面越陡峭表示兩因素的交互作用顯著。因此，這2個因素接近零水平時，即pH接近8.0、酶解溫度接近50 ℃時，水解度出現最高值。由圖6中(f)可知，當加酶量為0.8%，pH為8.0時，由于時間和溫度這2個因素的一次項和二次項對響應面都有顯著的影響，在一定范圍內，水解度會隨著時間和溫度的升高而升高，時間和溫度在接近零水平時，即酶解時間為3 h和酶解溫度為50 ℃時，水解度出現最高值。響應面分析也說明我們確定的最佳加酶量、pH值、酶解時間和酶解溫度都在設定的試驗范圍內。

3 驗證試驗

通過中心組合設計優化和對擬合模型方程的分析，獲得了擬合方程的最大值點，即加酶量0.84%、pH 7.96、時間3.37 h、酶解溫度53 ℃。為考察該點和實際值的差異，特別是在pH<8.00這樣一種超出考察范圍的條件下的擬合度，需要在該條件下，進行酶解南美白對蝦蝦頭驗證試驗。驗證試驗除所求的4個條件不一樣之外，其余條件，包括設備和設計響應面的酶解試驗均相同。試驗3次平行所測得的水解度為43.85%，43.88%，43.91%，這與43.92%的預測值存在可接受的誤差，故取平均值為43.88%±0.03%，在本試驗中，在試驗考察范圍之外的該點處，方程失去了較少的擬合度，該方程比較理想，最優組合較可靠。

4 結論

廣西北部灣地區南美白對蝦蝦頭營養豐富，尤其是蛋白含量較高；通過響應面法對蝦頭進行酶解工藝優化，建立了蝦頭蛋白水解度的回歸模型為DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D-1.25000BC-0.11875BD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。優化所得最佳條件為加酶量0.84%、pH 7.96、時間3.37 h、酶解溫度53 ℃，在此條件下，水解度為43.88%±0.03%。為廣西北部灣南美白對蝦下腳料利用提供了數據， 可獲得風味良好的蝦調味料基液。