動(dòng)物蛋白水解酶法制備南極磷蝦多肽及其抗氧化活性

，，，

(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué) 海洋與漁業(yè)研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022)

南極磷蝦(Euphausiasuperba)是存在于南極海域的海洋浮游生物，生物資源量巨大，是地球上最大的潛在動(dòng)物性蛋白資源庫(kù)[1]。南極磷蝦蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，其生物價(jià)高于牛乳蛋白和其他動(dòng)物性蛋白，必需氨基酸含量和評(píng)分也高于FAO/WHO推薦的理想蛋白模型，支鏈氨基酸/芳香族氨基酸比值接近正常人的水平，極具開發(fā)應(yīng)用潛力[2]。蛋白酶水解法是回收食品原料中蛋白質(zhì)的有效手段之一，通過(guò)添加外源酶酶解得到的水解蛋白營(yíng)養(yǎng)豐富，腸道吸收更好，生物活性更優(yōu)異，包括抗氧化、降血壓、降血糖、抗菌等活性[3]。此外，蛋白水解后可用于制作風(fēng)味制品，也可作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑加入到其他食品中，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人們普遍關(guān)注的研究熱點(diǎn)[4]。實(shí)驗(yàn)室前期制備了2種南極磷蝦蛋白產(chǎn)品——蝦糜和蛋白。因此，本文以它們?yōu)樵?，通過(guò)動(dòng)物蛋白水解商業(yè)復(fù)合酶制劑，制備南極磷蝦多肽，研究酶解參數(shù)，分析多肽分子量組成，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為南極磷蝦的精深加工提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

南極磷蝦：由作業(yè)船在南極海域捕撈，捕撈后迅速保存在-30 ℃冰柜中，冷凍方式：運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，貯藏于超低溫冰箱中；動(dòng)物蛋白水解酶(2×105U/g)：河北格貝達(dá)生物科技有限公司；羥基自由基清除能力試劑盒和總抗氧化能力試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞色素C(12400 Da)、抑肽酶(6511.44 Da)、維生素B12(1355.38 Da)、谷胱甘肽(612.63 Da)和胞苷(242.2 Da)：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti JXN-30型冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；FreeZone 12型冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Labconco公司；KjelFlex K-360型凱氏定氮儀 瑞士Buchi有限公司；UV-3100BPC型分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；超高效液相色譜儀(UPLC) 美國(guó)Waters公司。

1.3 南極磷蝦蝦糜和蛋白的制備

南極磷蝦蝦糜和蛋白為實(shí)驗(yàn)室自制，前者通過(guò)等電點(diǎn)沉淀法制備[5]，后者通過(guò)堿提酸沉法提取[6]，分別收集樣品，凍干備用。

1.4 南極磷蝦多肽的制備

以凍干南極磷蝦蝦糜粉和蛋白粉為原料，按液料比3∶1 (mL/g)加水復(fù)溶，調(diào)pH(7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，加入動(dòng)物蛋白水解酶，加酶量為500，1000，1500，2000，2500 U/g，在不同溫度下(40，45，50，55，60 ℃)保溫1，2，3，4，5 h，酶解結(jié)束后沸水浴滅酶5 min。10000 g條件下離心15 min，取適量上清液，按1.5項(xiàng)下方法測(cè)定其水解度。其余上清液，凍干備用。

1.5 多肽水解度的測(cè)定

酶解上清液中可滴定氮含量參考鄒大維等人的方法，通過(guò)甲醛固定、堿液滴定測(cè)定[7]?？偟蓜P氏定氮法測(cè)定。水解度(%)按公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

水解度=游離氨基氮/總氮量×100%。

(1)

1.6 多肽分子量范圍測(cè)定[8]

采用Waters ACQUITY UPLC I-Class(紫外檢測(cè)器)對(duì)南極磷蝦多肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定。色譜柱：Peptide CSH C18(130 ?，1.7 μm，2.1 mm×100 mm)。流動(dòng)相A：含0.1%(V/V)三氟乙酸的超純水，流動(dòng)相B：含0.1%(V/V)三氟乙酸的乙腈。梯度洗脫條件：初始條件為2%的B，在20 min時(shí)將B增加到50%，維持6 min后，將流動(dòng)相B調(diào)節(jié)至2%，總時(shí)間為30 min。檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm和280 nm，柱溫40 ℃，流速0.1 μL/min，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)樣濃度0.02 g/mL。樣品分子量分布根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間確定。

1.7 羥基自由基清除能力測(cè)定

酶解凍干物用去離子水配成不同濃度(1.0～5.0 mg/mL)備用。羥基自由基清除測(cè)定參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。首先，將0.15 mL試劑1、0.4 mL試劑2和0.1 mL試劑3迅速混勻，防止局部顏色過(guò)濃。再加入0.25 mL樣品和0.1 mL試劑4，混勻，37 ℃下溫育60 min。反應(yīng)結(jié)束后，10000 g離心10 min，測(cè)定536 nm下的吸光度值?？瞻捉M用去離子水替代樣品和試劑4，對(duì)照組用去離子水替代樣品。清除率按公式(2)計(jì)算：

清除率=(A樣品-A對(duì)照)/(A空白-A對(duì)照)×100%。

(2)

1.8 總抗氧化能力測(cè)定

酶解凍干物用去離子水配成不同濃度(1.0～5.0 mg/mL)備用?？偪寡趸芰y(cè)定參考試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。先繪制FeSO4濃度與反應(yīng)吸光度變化(ΔA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。再將試劑1、試劑2和試劑3按7∶1∶1的比例混合，使用前預(yù)溫至37 ℃。取上述混合液900 μL，加入30 μL樣品(V樣品)和90 μL去離子水，充分混勻，此時(shí)總體積為1.02 mL(V反應(yīng))，反應(yīng)10 min，測(cè)定593 nm處的吸光度A測(cè)定。對(duì)照組用去離子水代替樣品，測(cè)定得A對(duì)照。計(jì)算樣品的ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到對(duì)應(yīng)的Fe2+濃度x(μmol/mL)。總抗氧化能力按公式(3)計(jì)算：

總抗氧化能力(U/mL)=(x×V反應(yīng))/V樣品。

(3)

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)和多重Duncan比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

溫度是影響動(dòng)物蛋白水解酶活性的主要因素之一。本研究在pH 8.0、加酶量2000 U/g、酶解時(shí)間3 h的條件下，測(cè)定40～60 ℃下動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖1。

圖1 溫度對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.1 Effect of temperature on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

注：相同字母代表差異不顯著(P>0.05)，下同。

由圖1可知，動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白的酶解效果隨著溫度的升高均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，50 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大值。當(dāng)溫度低于50 ℃時(shí)，動(dòng)物蛋白水解酶隨著溫度升高，反應(yīng)速率加快，催化效率增強(qiáng)，水解度隨之顯著增大(P<0.05)；當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，動(dòng)物蛋白水解酶的活性降低，反應(yīng)速率降低，水解度隨之顯著減小(P<0.05)。因此，選擇50 ℃作為酶解最優(yōu)溫度，這與通過(guò)動(dòng)物蛋白水解酶酶解單環(huán)刺螠體壁肌的研究結(jié)果一致[9]。

2.2 pH對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

與溫度類似，pH也是影響動(dòng)物蛋白水解酶活性的主要因素。本研究在溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、酶解時(shí)間3 h的條件下，測(cè)定pH 7.0～9.0下動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖2。

圖2 pH對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of pH on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由圖2可知，動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白的酶解效果隨著pH的升高也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH為8.0時(shí)，水解度達(dá)到最大值，當(dāng)pH低于8.0時(shí)，動(dòng)物蛋白水解酶活性隨pH增大而增強(qiáng)，所以水解度隨之顯著增大(P<0.05)；當(dāng)pH>8.0時(shí)，動(dòng)物蛋白水解酶的活性降低，水解度隨之顯著減小(P<0.05)，因此，8.0為最佳酶解pH。徐錦等人研究了6種商品蛋白酶對(duì)鰱魚蛋白的水解效果，同樣發(fā)現(xiàn)動(dòng)物蛋白酶的最優(yōu)酶解pH為8.0，與本文的結(jié)果一致。

2.3 加酶量對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

加酶量是影響動(dòng)物蛋白水解效率的重要因素。本研究在溫度50 ℃、pH 8.0、酶解時(shí)間3 h的條件下，測(cè)定500～2500 U/g加酶量下動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖3。

圖3 加酶量對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.3 Effect of additive amount of enzyme on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由圖3可知，當(dāng)南極磷蝦蝦糜和蛋白原料底物充足時(shí)，動(dòng)物蛋白水解酶的酶解效果隨著加酶量的增加呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)(P<0.05)，但當(dāng)加酶量超過(guò)2000 U/g時(shí)，由于酶解底物蛋白量有限，水解度無(wú)顯著性變化(P>0.05)。因此，確定2000 U/g為最優(yōu)加酶量。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白酶解效果的影響

酶解時(shí)間是影響動(dòng)物蛋白水解酶活性的因素之一。本研究在溫度50 ℃、pH 8.0、加酶量2000 U/g的條件下，測(cè)定酶解時(shí)間1～5 h下動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度，結(jié)果見圖4。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白水解效果的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on proteolysis of Antarctic krill surimi and protein

由圖4可知，在前3 h內(nèi)，動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)南極磷蝦蝦糜和蛋白的水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(P<0.05)，然而，當(dāng)時(shí)間超過(guò)3 h時(shí)，由于南極磷蝦蝦糜和蛋白得到了充分水解，水解度無(wú)顯著性變化(P>0.05)。因此，確定3 h為最優(yōu)酶解時(shí)間。戴志遠(yuǎn)等人從呈味角度分析了動(dòng)物蛋白水解酶對(duì)梅魚酶解的效果，發(fā)現(xiàn)充足的酶解時(shí)間(4 h)有利于鮮味游離氨基酸的獲得，可提高產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)[10]。

2.5 南極磷蝦多肽的分子量分布

圖5 南極磷蝦蝦糜多肽和蛋白多肽的UPLC色譜圖Fig.5 UPLC chromatograms of peptides derived from Antarctic krill surimi and protein

本文采用反相UPLC測(cè)定了南極磷蝦蝦糜多肽和蛋白多肽的分子量分布。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，南極磷蝦蛋白被水解成不同分子量肽段的混合物，其大小分布見圖5。

由圖5可知，動(dòng)物蛋白水解酶水解南極磷蝦蝦糜和蛋白得到的多肽分子量集中在311～2963 Da之間。在波長(zhǎng)214 nm下，2種原料來(lái)源的多肽都檢測(cè)到分子量為311，347，606，971，1483 Da的多肽；在波長(zhǎng)280 nm下，來(lái)自南極磷蝦蛋白的樣品額外檢測(cè)到分子量為2963 Da的肽段。從分子量來(lái)看，本研究制備的南極磷蝦多肽符合生物活性肽分子量范圍大小(<6000 Da)，具有表現(xiàn)一定生物活性的潛力[11]。

2.6 南極磷蝦多肽抗氧化活性

Sila和Bougatef發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品是生物活性肽開采的巨大資源，尤其是抗氧化肽，如三肽Ser-Cys-His、四肽Ala-Cys-Phe-Leu、五肽Gly-Ser-Gly-Gly-Leu等[12]。如2.5所述，本文制備的南極磷蝦多肽具有一定活性潛力，因此，本文選取抗氧化性對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2.6.1 羥基自由基清除能力

圖6 南極磷蝦多肽的羥基自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging capacity of Antarctic krill peptides

由圖6可知，2種原料制備的南極磷蝦多肽對(duì)羥基自由基的清除率存在顯著差異(P<0.05)，并且隨著濃度的升高而增大，這可能與兩者組成的差異性有關(guān)。在多肽濃度為5.0 mg/mL時(shí)，羥基自由基的清除率最大，蝦糜多肽為16.7%±1.2%，蛋白多肽為25.0%±1.5%。陽(yáng)性對(duì)照組VC在濃度0.5 mg/mL時(shí)，羥基自由基的清除率為43.6%±1.5%，與陽(yáng)性對(duì)照相比，南極磷蝦多肽的羥基自由基清除能力較弱。

2.6.2 總抗氧化能力

圖7 南極磷蝦多肽的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of Antarctic krill peptides

由圖7可知，2種原料制備的南極磷蝦多肽的總抗氧化能力隨多肽濃度的升高而增大，但二者差異不顯著(P>0.05)，在多肽濃度為5.0 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力最大，蝦糜多肽為(0.11±0.03) U/mL，蛋白多肽為(0.17±0.02) U/mL。陽(yáng)性對(duì)照組VC在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，總抗氧化能力高達(dá)(1.08±0.04) U/mL，與陽(yáng)性對(duì)照相比，南極磷蝦多肽的總抗氧化能力較弱。

3 結(jié)論

本文將動(dòng)物蛋白水解酶制劑應(yīng)用于南極磷蝦蝦糜和蛋白的制備得到具有一定抗氧化能力的生物活性肽。單因素實(shí)驗(yàn)表明最優(yōu)的酶解溫度為50 ℃，pH為8.0，加酶量為2000 U/g，酶解時(shí)間為3 h。在此條件下酶解，南極磷蝦多肽的分子量范圍為311～2963 Da，且具有一定的羥基自由基清除能力和鐵還原能力。