花生醋浸過程中蛋白質、多肽含量變化及其抗氧化性的研究

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(1.鎮江恒順生物工程有限公司,江蘇 鎮江 212021；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院 植物源功能食品北京市重點實驗室，北京 100083)

近代醫學發現，用醋浸泡的食物有防治疾病的作用，特別是對高血壓、冠心病、糖尿病、肥胖癥、感冒、干咳及延緩衰老有特殊作用，因而醋方在近年來成為大眾青睞的養生之道[1]。自由基理論的提出讓人類認識到人體內氧化產生的自由基與人的衰老和許多疾病有關[2]。而抗氧化劑可以清除體內過多的自由基，因而人通過適當攝入具有抗氧化活性的物質可以降低體內自由基的水平，防止脂質過氧化，幫助機體抵御疾病[3]。國內外研究證實多種不同來源的多肽成分具有抗氧化活性，如玉米多肽、大米多肽、羅非魚多肽、魚精多肽等[4-7]。魏振承等[8]發現花生多肽飲品具有抗氧化和緩解體力疲勞的作用。陳貴堂等[9]通過開展花生多肽對氧化損傷模型小鼠抗氧化作用的研究發現花生多肽有較強的抗氧化功能性。在相關實例性報道中指出食用醋泡花生有利于降低血壓，降血脂，軟化血管，減少膽固醇累積，有預防心血管疾病的功效。而這些功效的實現與抗氧化性息息相關。然而目前對于醋泡花生的研究主要集中于營養成分分析方面，但對于醋花生功能特性的相關研究較少。因而本文通過探究醋泡花生抗氧化性的變化以及醋浸過程中蛋白質和多肽含量的變化，以期為醋泡花生在功能食品方面的實際應用和進一步開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

生花生、老陳醋、香醋：鎮江恒順生物工程有限公司提供；DPPH、Tris： Sigma-Aldrich試劑公司；還原型谷胱甘肽(GR)： 上海雅吉生物科技有限公司；無水乙醇、鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、標準滴定鹽酸、98%濃硫酸、硫酸鉀、無水硫酸銅、三氯乙酸、抗壞血酸：均為分析純，北京化工廠。

pHS-3C型pH計 上海三信儀表廠；HR2870型粉碎機 飛利浦家庭電器有限公司；V-5000型分光光度計、ALC-210.2型分析天平 北京愷欣科技發展有限公司；GL-20G-II型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；FD-1A-55型冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；Biorab Model 550型酶標儀、康寧透明96孔板 Bio-Rad生命醫學產品有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 醋花生制作

本實驗按照醋500 g、花生300 g的比例分別泡制了2種醋花生：陳醋、生花生、香醋+生花生。

1.2.2 樣品處理

干燥：在花生浸泡的第0，3，5，7，10，13天分別取樣60 g，于40 ℃鼓風干燥至恒重，-20 ℃保存。 脫脂：取干燥好的樣品20 g，粉碎。加入適量正己烷，搖瓶振蕩1.5 h，6000 r/min離心5 min，重復以上操作直至上清液澄清透明。棄去上清液，待固體風干24 h后于-80 ℃凍藏保存。

1.2.3 醋液pH測定

取醋泡花生浸泡第0，3，5，7，10，13天的醋液，使用pHS-3C型pH計分別測定其pH值。

1.2.4 粗蛋白含量測定

參照GB/T 5009.5-2010《食品中蛋白質含量的測定》(附錄一)中第一法凱氏定氮法，根據實驗實際情況略有改動。稱取固體試樣0.1 g，移入干燥的消化管中。加入硫酸銅與硫酸鉀混合試劑(1∶8.75)1.5 g及15 mL 98%濃硫酸，置于通風櫥內的消化爐中消化至液體呈藍綠色并澄清透明。取下放冷后，至凱氏定氮儀進行測定。每個樣品做3組平行測定。

1.2.5 多肽含量測定

參考刁文睿等[10]的方法，根據實際情況略有改動。用5% TCA水溶液依次配制0，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的還原型谷胱甘肽溶液于10 mL容量瓶中，然后分別取6.0 mL標準溶液，加入4.0 mL雙縮脲試劑，混勻，靜置10 min。2000 r/min離心10 min，在540 nm下測定吸光值。以多肽質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，制作標準曲線。稱取0.3～0.5 g樣品，加入25 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.8)提取1 h，4 ℃，8000 r/min離心15 min，取上清液。上清液加入等體積的12%三氯乙酸，混合后靜置30 min，4 ℃，8000 r/min離心15 min，沉淀大分子蛋白質，所得上清液即為肽提取液。取6.0 mL上清液置于另一試管中，加入雙縮脲試劑4.0 mL，混勻，靜置10 min。2000 r/min離心10 min，在540 nm下測定吸光值。每個樣品做3組平行測定。

1.2.6 DPPH自由基清除法測定抗氧化性

分別配制4，8，12，16，20 μg/mL的抗壞血酸溶液，用酶標儀測定其清除率，然后以樣品濃度為橫坐標，清除率為縱坐標，繪制Vc當量標準曲線。取脫脂花生2 g，加入25 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.8)，置磁力攪拌器上，攪拌提取0.5 h后，4 ℃ 8000 r/min 離心15 min，再重復以上過程1次，合并2次上清液為多肽提取液。將提取液置于-80 ℃冰箱凍藏至完全凍住后，置凍干機凍干。在517 nm下，分別測定2 mL DPPH無水乙醇溶液(0.01 mmol/L)與2 mL樣品溶劑混合液充分振蕩反應靜置30 min后的吸光值A0，2 mL DPPH無水乙醇溶液(0.01 mmol/L)與2 mL樣品混合液充分振蕩反應靜置30 min的后吸光值A1，2 mL無水乙醇溶液(0.1 mmol/L)與2 mL樣品混合液充分振蕩反應靜置30 min后吸光值的A2。清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。每個樣品做3組平行測定。

2 結果與分析

2.1 花生醋浸過程中醋液pH的變化

圖1 醋花生醋浸過程中食醋pH的變化Fig.1 The pH changes of vinegar soaked peanuts

由圖1可知，2種醋花生在泡制過程中，醋液pH值呈現相同的變化規律。在浸泡0～3天的過程中，pH值升高顯著，隨著浸泡時間的延長，pH值略有下降后維持穩定。在醋豆的相關研究中，豆子經過醋浸泡后，含酸量變化也呈現相似規律。由于醋酸的作用，大豆中的大分子降解，致使總蛋白和可溶性蛋白含量降低，而可溶性糖和還原糖含量顯著增加。水解產物溶解到醋液中，留存在醋大豆中的蛋白質、氨基酸、總糖、還原糖和總黃酮含量均相應降低[11]。因而推斷花生醋浸過程中醋液pH值的上升可能是由于大分子蛋白在食醋酸性條件下發生水解，生成了小分子的花生多肽。同時有部分水解產物溶解到醋液中，從而引起醋液pH值的變化。另一方面，大分子蛋白經過水解后，溶于醋液中的小分子多肽因其酸性殘基和堿性殘基的暴露也會影響醋液pH值的變化[12]。

2.2 花生醋浸過程中蛋白質及多肽含量的變化

圖2 花生醋浸過程中粗蛋白含量變化Fig.2 The crude protein content changes of vinegar soaked peanuts

由圖2可知，隨著浸泡時間的延長，粗蛋白含量下降。在浸泡到13天時，用香醋浸泡的花生粗蛋白含量下降了18.03%，而陳醋浸泡的花生粗蛋白含量下降了22.64%。

圖3 花生醋浸過程中多肽含量變化Fig.3 The polypeptide content changes of vinegar soaked peanuts

通過實驗，得到多肽含量測定的標準曲線公式為y=0.5163x+0.0002(R2=0.9996)。由圖3可知，醋花生多肽含量的變化先增加后趨于穩定。其中，用陳醋浸泡的花生在第7天時，多肽含量達到峰值，含量為(5.38±0.07) g/kg。而香醋浸泡的花生，多肽含量在第10天達到峰值(3.83±0.11) g/kg。多肽含量達到峰值后，略有下降后趨于平緩。江晨等[13]對花生多肽的溶解性進行了研究，發現花生多肽在pH為4.5(等電點)時溶解性最小，在pH值2～5時，溶解性隨著pH值的升高而降低，在pH值5～12時，溶解性隨著pH值的升高而升高，花生肽在pH值2～12的范圍內都保持著較高的溶解性(≥87%)。在本研究中的pH測定實驗發現，2種醋花生醋液pH值均保持在4.5以下，pH值峰值接近4.5。因而，花生在醋液浸泡前期，醋花生中多肽含量增多。隨著浸泡時間延長，醋液pH值升高，花生多肽的溶解性降低，直至pH接近等電點4.5時，花生多肽不再繼續溶解。在浸泡后期，醋花生的多肽含量在達到峰值后略微下降而后趨于穩定。

2.3 花生醋浸過程中抗氧化性變化

試驗測得，Vc當量標準曲線y=4.7297x+2.8562(R2=0.9941)，經數據處理得到花生醋浸過程中Tris-HCl提取物抗氧化性的變化，見圖4。

圖4 花生醋浸過程中Tris-HCl提取物抗氧化性的變化Fig.4 The antioxidant activity changes of Tris-HCl extract of vinegar soaked peanuts

由圖4可知，花生經過醋浸后，Tris-HCl提取物的抗氧化性提高，且在浸泡前3天時增長顯著，浸泡后期趨于平緩。2種食醋浸泡的花生抗氧化能力變化沒有明顯的差異。實驗結果顯示醋花生抗氧化性的變化與多肽含量變化都呈增長趨勢，且在浸泡前期增長顯著。花生中含有大量的功能活性成分，其中花生仁含脂肪50%左右，含蛋白質24%～36%，除了富含油脂和蛋白質之外，花生仁還富含植物固醇、類黃酮、維生素和微量礦物質等[14]。在本研究中，已經對花生進行脫脂處理，因而脫脂花生中的主要營養成分為蛋白質。結合本研究中花生多肽含量變化結果可知，花生經過食醋浸泡，花生蛋白水解為小分子多肽，已有報道花生多肽具有清除自由基和抗氧化作用，且pH值在3～7時，對DPPH自由基的清除效果較好(>80%)[15],花生多肽可以被Tris-HCl提取出來，因而推斷花生醋浸過程中其抗氧化性變化可能與多肽含量的變化有相關關系。花生經過食醋浸泡后，在浸泡前期，花生多肽含量顯著增多，因而其多肽抗氧化性也增長顯著。根據實驗結果還發現，花生在浸泡至第3天時，抗氧化性已達到峰值并趨于穩定，但其多肽含量仍在繼續增多，在浸泡7天后才達到峰值。分析其原因可能為以下三點：第一，目前發現的抗氧化肽，它們的氨基酸殘基數多小于20，分子量均較小[16]。醋液提供的酸性環境，使得一部分具有抗氧化活性的小分子花生多肽溶解于醋液中，因而即使醋花生多肽含量在增多，但其抗氧化性增長卻減緩。第二，王戈莎[17]發現肽濃度較低時，粳米多肽與DPPH的電子能夠很好地結合，因而隨著肽濃度的增大，Protese N水解所得粳米多肽的DPPH清除率也相應增大。當肽的濃度增大至70%時，粳米多肽和DPPH的電子結合接近于飽和，使得清除率的增長速度減慢。因而推斷在本研究中，醋花生多肽抗氧化性的變化也與花生多肽與DPPH電子結合度有關，隨著花生多肽濃度增大，花生多肽與DPPH電子結合接近于飽和，因而其抗氧化性增長減緩并趨于穩定。第三，食醋中富含有機酸，于麗娜等[18]發現加入檸檬酸和酒石酸會對花生抗氧化能力有較大影響，其中檸檬酸的加入會使花生抗氧化肽清除DPPH自由基的效果下降。因而推斷在花生醋浸過程中，食醋中檸檬酸、酒石酸等有機酸對花生抗氧化肽的供電能力造成了影響，導致清除DPPH自由基效果下降。

相關研究表明肽的抗氧化性不僅和分子量相關，還和肽的氨基酸組成和序列相關。有研究指出，抗氧化活性肽的作用機制與疏水性氨基酸、抗氧化氨基酸和酸性氨基酸及其構象密切相關。本實驗獲得的結果的機制還需要進一步研究。

3 結論

上述研究結果表明，花生醋浸過程中，由于食醋中酸性物質的作用，大分子蛋白降解為具有抗氧化活性的小分子功能肽，因而醋花生的抗氧化性提高。隨著浸泡時間的延長，由于可水解的大分子蛋白減少，溶解于醋液中的花生多肽增多，同時花生多肽與DPPH電子的結合度趨于飽和以及醋液中酒石酸、檸檬酸等有機酸的影響，使得在浸泡后期的醋花生多肽抗氧化能力的增長趨于穩定。本研究結果對進一步探究醋泡花生的抗氧化性提供了研究思路及參考。在今后的實驗研究中也可以將醋泡花生的醋液作為研究對象，探究其營養成分及抗氧化能力的變化，以期為更進一步開發醋花生這一保健食品提供更全面的參考依據。