自動電位滴定準確檢測醬油還原糖含量的研究

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(李錦記(新會)食品有限公司，廣東 江門 529156)

醬油在發酵過程中,淀粉質原料被分解產生還原糖,還原糖不僅有助于醬油生色,而且可以被酵母利用生成醇、酸、酯等香氣成分[1],特別是還原糖含量與醬油風味物質的生成密切相關。因此,還原糖含量對于醬油的色、香、味都有較大影響,是醬油釀造過程中的一項重要參數。

醬油中還原糖含量的傳統測定方法是依據GB 5009.7-2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》， 該方法中的直接滴定法，其滴定條件需要人工控制，且反應熱源、滴定速度、滴定體積等因素控制對測定結果的影響很大。還需人手在高功率電爐上準確操作，有一定的技術難度和勞動強度，滴定終點靠人的肉眼來判斷，誤差大[2]。而應用電位滴定技術自動檢測還原糖的方法，在葡萄酒和飲料中已有相關研究[3-5]。

原理：在試劑除去蛋白質的干擾后，將一定量的斐林試劑甲、乙液混合后，生成天藍色的氫氧化銅沉淀，沉淀很快與酒石酸鉀鈉反應，生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡合物，在加熱的條件下，以亞甲基藍作為指示劑，用0.1%葡萄糖標準溶液進行滴定，還原糖的醛基作為還原部位與酒石酸鉀鈉銅反應，生成紅色的氧化亞銅沉淀，待二價銅全部被還原后，稍過量的還原糖將亞甲基藍還原為其隱色體，溶液的藍色消失，即為滴定終點。本文采用自動滴定儀、復合Pt環電極、氧化還原滴定法，應用能斯特方程電位突躍指示法自動識別滴定終點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發酵醬油：李錦記(新會)食品有限公司。

硫酸銅、亞甲基藍、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰0.1%葡萄糖標準溶液：精確稱取在101 ℃ 烘2～3 h至恒重的分析純無水葡萄糖1.000 g，放入100 mL燒杯中，用蒸餾水定容至1 L，為防染菌，可加5 mL濃鹽酸。

1.2 儀器與設備

905自動電位滴定儀、復合Pt環電極 瑞士萬通(中國)有限公司；C-MAG HS7 Control加熱攪拌器 德國IKA集團；天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 參數設定調試

選取有RS 232接口的加熱攪拌器，接入電腦，采用905自動電位滴定儀、復合Pt金屬環電極、智能滴定軟件Tiamo，參照國標GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》方法，設定滴定程序和參數，再進行多次樣品測試，對反應過程的各關鍵影響參數(加熱面板溫度、攪拌速度、終點電位評估等)逐一進行研究優化。

試樣正式滴定：待電爐預熱溫度至430 ℃左右， 向小燒杯中加入斐林甲液、乙液各5 mL，加入1 mL稀釋樣品，放在電爐中央，選擇方法“正式滴定”，點擊“開始”， 在“Sample Size”欄輸入預加葡萄糖的mL數(約比預備滴定少1 mL)，點“繼續”進行預加體積，待液體沸騰時，點“繼續”， 將滴定管和電極小心放進液體里， 軟件自動開始計時沸騰30 s，然后開始等量MET滴定，待滴定終點出現后，滴定停止，自動計算結果并寫入設備。

1.3.2 精密度測試

選取3個不同的醬油樣品，應用以上經調試后的滴定程序參數，進行自動電位法滴定醬油中還原糖的含量。每個樣品分別平行測定5次，分析結果。

1.3.3 加標回收率測試

準確稱量0.500,1.000,2.000,5.000 g葡萄糖標樣，分別加入4份100 mL的醬油b樣品中，應用以上方法滴定，測定加標前、加標后樣品的還原糖含量。每個樣品分別平行測定3次，分析結果。

2 結果與分析

2.1 還原糖含量檢測的程序參數

2.1.1 加熱溫度對結果的影響

反應液的溫度與溶解氧的含量有直接的關系。溫度越高，溶解氧含量越低。滴定時要保持沸騰狀態，使上升的蒸汽阻止空氣侵入反應體系中。因此溫度的變化對測定結果有很大的影響[6-9]。按以上滴定程序，分別設置不同的加熱溫度340,380,410,430,450 ℃，測定同一醬油樣品的還原糖含量。

圖1 還原糖滴定程序Fig.1 Reducing sugar titration procedure

加熱溫度(℃)還原糖含量(g/dL)結果1結果2結果3平均值3802.6642.5692.6272.6204102.7722.7952.7232.7634302.8522.9262.8942.8914502.8812.8672.9142.887

由表1可知，加熱溫度較低時，結果較低，即滴定消耗的葡萄糖體積增加。加熱溫度為430 ℃時和450 ℃結果相近，430 ℃已能提供足夠穩定的熱源，并保證其后滴定過程保持沸騰狀態。避免采用450 ℃或更高的溫度對儀器設備帶來的不良影響。

2.1.2 攪拌速度對結果的影響

反應液攪拌用的轉子大小和攪拌的轉速不同，可引起測定誤差。轉子長度大的轉動力度大，轉動時反應液會產生較大的漩渦，造成電極浸泡不到反應液而引起的檢測誤差，易觸碰到玻璃電極造成損壞。本研究使用較小的磁力轉子(長8 mm)，通過調整不同的轉速來測定比較，結果見表2。表明轉速小的，檢測結果低，即滴定終點滯后，滴定消耗的葡萄糖體積增加。500 r/min已是本儀器的最大設置值，50 mL小燒杯反應液面沒有產生較大的漩渦，可滿足盡量減少測定誤差的要求。

表2 攪拌速度對結果的影響Table 2 Effect of stirring speed on results

2.1.3 滴定速度對結果的影響

國標方法要求嚴格控制滴定的速度，1滴/2 s，人手控制的準確性差，個體差異大。本研究應用電腦程序精準控制滴定速度，分別設為0.05 mL/s，0.05 mL/2 s，0.05 mL/3 s，結果見表3。

表3 滴定速度對結果的影響Table 3 Effect of titration speed on results

由表3可知，滴定速度越快，滴定消耗的葡萄糖體積越大，結果越小。滴定速度越慢，0.05 mL/3 s，滴定時間越長，反應液的沸騰時間長會引起水分蒸發量大，堿液濃度增高。在一定范圍內，溶液堿度越高，二價的銅還原越快，滴定消耗的體積越小，結果越大。為保持檢測的穩定性，應嚴格控制滴定速度和滴定時間。

2.1.4 滴定終點電位評估

還原糖測定的氧化還原反應，應用MET U模式等量滴定，受滴定速度1滴/2 s，反應可逆等因素影響，終點電位突躍不大。若標準設置較大(如>15 mV)，有可能造成儀器無法自動判別出終點；若標準設置較小(如<8 mV)，則可能提前識別出終點，即滴定消耗量偏小，滴定結果偏高。經評估，對等當量識別標準EPC設為10 mV較適合。

經以上測試，得出還原糖含量滴定在優化參數，加熱面板溫度430 ℃、攪拌速度500 r/min，滴定速度0.05 mL/2 s，終點判斷電位評估標準為10 mV。應用Tiamo軟件建立的設置見圖2。

圖2 還原糖滴定參數設置Fig.2 Setting of titration parameters for reducing sugar

2.2 回收率驗證

用標準溶液驗證，計算檢測方法的偏差，判斷方法的可行性，進行回收率驗證，驗證數據見表4。

表4 標準溶液回收率結果Table 4 Recovery test of standard solution

再依據GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中關于回收率范圍的規定[10]，見表5。

表5 回收率范圍Table 5 The range of recoveries

得出結論：配制濃度為0.1～10 g/dL的樣品檢測符合回收率范圍規定，此儀器檢測0.1～10 g/dL范圍的樣品結果符合使用。

2.3 醬油樣品還原糖檢測的精密度測試

表6 醬油還原糖含量檢測結果精密度Table 6 Precision of test results of reducing sugar content in soy sauce

由表6可知，應用自動電位滴定法測定3個不同的醬油樣品中還原糖的含量，RSD值分別為1.32%，1.13%，1.14%，均<2.00%，結果符合《含量測定分析方法驗證的可接受標準》中關于精密度的要求[11]，說明此方法的檢測結果準確穩定，精密度高。

圖3 自動電位滴定還原糖含量譜圖Fig.3 Spectrum of reducing sugar content by automatic potentiometric titration

由圖3可知等量滴定模式(MET U)下的滴定過程的曲線，能自動根據電位變化識別出等當點(EP1)，即滴定終點，避免因手工滴定需肉眼判斷顏色突變而引起的人為誤差，提高檢測結果的準確度。

2.4 醬油樣品還原糖加標回收率的測試

表7 醬油還原糖加標檢測回收率Table 7 Recovery rates of reducing sugar in soy sauce

由表7可知，向醬油b樣品中加入定量的葡萄糖標樣(0.5～5 g/dL)，測定加標后的回收率，分別為99.00%，98.40%，96.60%，96.92%，都在95%以上，回收率平均值為97.73%。

同時考慮常規發酵醬油產品還原糖含量在0.5%～10%之間，因此儀器符合發酵醬油檢測還原糖的要求。

3 結論

應用電位滴定技術，電腦控制加熱和攪拌裝置，已摸索出較穩定的程序參數。采用此方法檢測醬油中還原糖含量，結果精密度高，大大避免了人手滴定造成的誤差(尤其添加醬色后的醬油人手滴定終點判斷極為困難[12])。為醬油發酵過程的質量監控提供了準確而有效的檢測監控。