復(fù)方五鳳草液對(duì)結(jié)核性潰瘍家兔創(chuàng)面愈合的影響

余 洋，黃子慧 ，錢佳燕，朱思洵

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，南京 210014）

結(jié)核性潰瘍[1]約占肺外結(jié)核半數(shù)以上，而且其病程纏綿，極難愈合，或愈后容易復(fù)發(fā)[2]，臨床治療難度頗大，給患者的工作生活帶來(lái)很大的困擾。多年臨床發(fā)現(xiàn)，我院內(nèi)協(xié)定方復(fù)方五鳳草液應(yīng)用于結(jié)核性潰瘍的治療，療效確切可靠[3-4]。因此本研究旨在通過(guò)建立結(jié)核性潰瘍動(dòng)物模型，觀察復(fù)方五鳳草液在干預(yù)家兔結(jié)核性潰瘍創(chuàng)面過(guò)程中TB-PCR的變化，探討該外用藥物促進(jìn)潰瘍愈合的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)雌性SD新西蘭兔，體質(zhì)量約2 000～2 500 g，平均（2162±80.9）g，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2012～0008。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將新西蘭兔隨機(jī)分為：1）模型組（結(jié)核性潰瘍）；2）異煙肼組；3）親水性纖維含銀輔料組；4）復(fù)方五鳳草液高劑量組；5）復(fù)方五鳳草液中劑量組；6）復(fù)方五鳳草液低劑量組；每組6只。

1.2 藥物制備 復(fù)方五鳳草液處方：五鳳草2000 g，白及240 g，貓爪草400 g等。制備工藝：將以上諸藥，加水浸過(guò)藥面，煎煮3次，1 h/次，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮分裝，生藥含量為2.64 g/mL（此為高劑量組）。將該藥液分別稀釋2倍、5倍，制成中、低劑量組。以上藥液由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥制劑室提供，4℃冰箱保存。

1.3 家兔結(jié)核性潰瘍模型制備 將凍存于- 80 ℃BCG菌種（蘭州大學(xué)結(jié)核病研究中心暨病原生物學(xué)研究所提供）取出，接種于改良羅氏培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2的條件下復(fù)蘇培養(yǎng)。待菌落形成（約3周）后，刮取菌落研磨，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集菌體，取一定量制備好的菌液進(jìn)行梯度稀釋。待菌落形成（約4周）后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定菌液濃度。菌液與50%丙三醇以3:2比例混勻，于- 70 ℃保存。新西蘭兔在常規(guī)飼養(yǎng)1周后，腹腔注射鹽酸氯胺酮（150 mg /kg體質(zhì)量）麻醉，在造模區(qū)（兩側(cè)腹背部）剃毛，接種100 μL。6周后以相同劑量再次皮下注射免疫，大概免疫后4周，可見(jiàn)類上皮增生為主的結(jié)核肉芽腫，并可見(jiàn)朗罕氏細(xì)胞（見(jiàn)圖1，圖2）。

1.4 給藥 造模成功后每2天予新西蘭兔潰瘍面換藥，用無(wú)菌棉片在藥液中浸濕后敷于潰瘍面后用紗布覆蓋并固定。按組分別予以復(fù)方五鳳草液高中低劑量、異煙肼注射液、親水性纖維含銀輔料，模型組予以普通油紗外敷。

圖1 結(jié)核性肉芽腫病理表現(xiàn)

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 創(chuàng)面愈合率 創(chuàng)面愈合率=（原始創(chuàng)面面積—時(shí)相點(diǎn)未愈合面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。在用藥前及用藥后第3、7、14、21天分別在透明紙上按新西蘭兔創(chuàng)緣描畫(huà)，通過(guò)掃描儀輸入微型計(jì)算機(jī)，采用軟件Osiris版本4. 19計(jì)算像素的方法進(jìn)行創(chuàng)面面積計(jì)算。以第一次測(cè)量的創(chuàng)面面積為潰瘍初始面積，以各時(shí)相點(diǎn)取材時(shí)測(cè)量的面積為時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面面積。

1.5.2 創(chuàng)面愈合時(shí)間 觀察并記錄所有新西蘭兔從創(chuàng)面用藥起到創(chuàng)面完全上皮化所需時(shí)間。

1.5.3 FQ-PCR定量檢測(cè) 用藥后第3、7、14、21天行局部麻醉，切取創(chuàng)面肉芽組織，應(yīng)用TB-PCR 熒光檢測(cè)試劑盒（上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司） 進(jìn)行TB-PCR 檢測(cè)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：借助熒光信號(hào)檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，PCR 每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，確定CT 值，根據(jù)CT 值確定起始DNA 拷貝數(shù)，進(jìn)行DNA 定量分析，對(duì)治療過(guò)程進(jìn)行結(jié)核桿菌量化監(jiān)控。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件單一指標(biāo)分析與多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。多指標(biāo)綜合評(píng)分法評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出各項(xiàng)指標(biāo)不同的權(quán)重。 以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組創(chuàng)面愈合率比較 見(jiàn)表1。

表1 各組創(chuàng)面愈合率比較（±s ，n=6） %

表1 各組創(chuàng)面愈合率比較（±s ，n=6） %

注：與模型組、陽(yáng)性藥物組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 第3天 第7天 第14天 第21天模型組 9.76±4.35 13.2±6.37 18.1±5.37 27.3±7.21高劑量組 10.1±3.97 36.6±9.24## 61.8±7.04 80.3±9.16##△△中劑量組 9.44±3.28 29.4±8.96## 43.2±6.15 58.9±4.37##△低劑量組 10.2±4.19 26.9±8.53# 36.3±4.39 46.8±6.23#異煙肼組 10.6±4.75 14.3±10.1 21.4±6.21 29.9±4.58親水性纖維含銀輔料組 11.0±3.91 25.9±11.4# 28.6±9.04 37.3±8.16#

2.2 各組創(chuàng)面愈合時(shí)間 見(jiàn)表2。

表2 各組創(chuàng)面愈合時(shí)間（n=6） d

2.3 各組TB-PCR定量檢測(cè)（CT值） 見(jiàn)表3。

表3 各組TB-PCR定量檢測(cè)（CT值）（n=6）

3 討論

結(jié)核性潰瘍常見(jiàn)于淋巴結(jié)核、骨結(jié)核等病變中后期破潰后形成的創(chuàng)面，還見(jiàn)于處于結(jié)核病活動(dòng)期或有結(jié)核感染史的患者身體某部位的長(zhǎng)期不愈之創(chuàng)面[5-6]，及接種卡介苗區(qū)域反復(fù)破潰不愈[7]。研究[8]報(bào)道糖尿病患者合并TB 頻發(fā)，其臨床治療難度較大，嚴(yán)重影響患者工作生活。

復(fù)方五鳳草液為老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方，以五鳳草、白芨、貓爪草為主藥等制作而成。其中五鳳草[9]（澤漆），性味辛苦，涼，有毒。有行水消痰、殺蟲(chóng)解毒功能。其藥理實(shí)驗(yàn)表明：能抑制結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)。白及[10]，有生肌、斂瘡、止血之功能。現(xiàn)代藥理研究，白及對(duì)結(jié)核桿菌有抑制作用。貓爪草[11]性味甘辛、溫，主治瘰疬。諸藥合用，共奏提膿去腐，活血生肌之效。且液態(tài)制劑，與創(chuàng)面“濕性愈合”之理念相吻合。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方五鳳草液能有效提高創(chuàng)面率，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，同時(shí)我們對(duì)創(chuàng)面組織中結(jié)核桿菌數(shù)量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，隨著創(chuàng)面漸趨愈合，TB-PCR的數(shù)量也同步逐漸減少，可見(jiàn)復(fù)方五鳳草液通過(guò)減少創(chuàng)面TB-PCR的數(shù)量有效促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。