祖師麻片對牛Ⅱ型膠原誘導大鼠關節炎的藥效學研究

程 龍，張天睿，董世芬，馬 丹，宋敬怡，張仲毅，張碩峰*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.山海關藥業有限責任公司，河北 秦皇島市 066200）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性疾病，其特征主要是手、足小關節的多關節、對稱性、侵襲性關節滑膜炎癥以及軟骨損傷[1]。目前，現代醫學對RA的發病機制尚未明確，一般認為與遺傳、環境等因素有關[2]。臨床治療RA的藥物有非甾體抗炎藥、抗風濕藥和植物藥制劑等，然而，這些藥物長時間服用具有嚴重的毒副作用，如胃腸道損傷、肝毒性以及增加心血管疾病的風險等[3-4]。

祖師麻為瑞香科植物黃瑞香（Daphne giraldii Nitsche）、陜甘瑞香（Daphne tangutica Maxim）及凹葉瑞香（Daphne retusa Hemsl）的莖皮和根皮，具有祛風通絡，散瘀止痛。研究發現，祖師麻具有抗炎、鎮痛、抗菌、抗腫瘤等藥理作用[5-7]。祖師麻片[8]用于治療風濕痹痛、關節炎、類風濕性關節，但其具體藥效機制尚不清楚。本研究采用牛Ⅱ 型膠原誘導的關節炎（collagen-induced anhritis，CIA）動物模型，來觀察祖師麻片對CIA模型大鼠類風濕性關節炎的藥效學影響，并探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 健康6周齡SPF級Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。合格證號：11400700241427，11400700249067。所有大鼠飼養于北京中醫藥大學屏障環境動物實驗室[SYXK（京）2016-0038]，室溫（25±2）℃、45%相對濕度，12 h/12 h光暗周期，飼養期間大鼠自由進食及飲水。

1.2 試劑及藥品 祖師麻片購于秦皇島市山海關藥業有限責任公司，批號為20160302；雷公藤多苷片購于湖北千金協力藥業有限公司，批號為20170302；戊巴比妥鈉購于北京化學試劑公司，批號為020402；弗氏不完全佐劑購于Sigma公司，批號為SLBQ2284V；牛II型膠原乳化劑購于Biotopped公司，批號為C7806；COX-2 、CTGF、RF、IgG、IL-6、PGE-2、TNF-α ELISA試劑盒購于Bluegene公司，批號分別為20170728、20170728、20171023、20170820、20180302、20180302、2018030。

1.3 儀器 半自動輪轉式切片機（德國徠卡（Leica）儀器有限公司）；正置智能型顯微鏡（奧林巴斯（中國）有限公司）；全自動多功能酶標儀（Thermo）；電熱恒溫培養箱(天津泰斯特)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物造模 參照文獻[9]方法，配制牛II型膠原乳化劑（每毫升乳劑含1 mg 牛II型膠原）。實驗時，于大鼠自尾根部皮內注射 0.1 mL 牛II型膠原乳劑，14 d后即第15天用同樣方法相同劑量再次加強注射第2次。正常對照組每次注射等劑量的生理鹽水。每周稱取一次體質量并記錄。

1.4.2 CIA模型評價 從第2次注射牛II型膠原乳化液開始，每天觀察造模大鼠關節的紅腫程度，對大鼠關節炎指數進行評分（AI評分）。AI評分判斷標準[10]：0分：前爪和后足沒有腫脹和局部發紅；1分：個別足趾輕度紅腫；2分：踝關節或腕關節輕度腫脹；3分：前爪、后足和關節嚴重發炎；4分：前爪、后足畸形或關節僵硬。每只大鼠均做觀察評分，評分總和即為CIA大鼠的AI評分。每隔1天計算一次。

1.4.3 分組與給藥 第二次注射牛II型膠原乳化劑后7 d，選取60只AI＞2的大鼠，用隨機分配法分為模型組、雷公藤多苷片組（陽性對照組）、祖師麻腸溶制劑高、中、低劑量組組、每組12只。正常組12只。雷公藤多苷片，按體臨床人最大用量為1.5 mg/（kg·d），即大鼠受試劑量為臨床人用量的6倍，即給藥劑量為9 mg/（kg·d）；祖師麻片9.9 g生藥/人/d（按祖師麻片藥典內容計算），按體質量75 kg計算，即1.32×102mg生藥/kg，大鼠受試劑量分別為臨床用量的12、6、3倍，即1.584×103mg、7.92×102mg、3.96×102mg生藥/kg。上述藥品溶于羧甲基纖維鈉溶液，共灌胃給藥10 d，1次/d，正常組、模型組給予等量羧甲基纖維鈉溶液。

1.4.4 取材 在給藥10 d后取材。大鼠以1.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心制備血清。沿后肢正中縱行切開皮膚直至暴露出膝關節，剪斷膝關節，放入4%多聚甲醛固定液中固定。

1.4.5 ELISA法檢測測血清中生長因子、免疫因子、風濕因子及炎癥因子 ELISA法測定大鼠血清中CTGF、IgG、RF、COX-2、IL-6、PGE-2 和 TGF-α含量。

1.4.6 膝關節番紅O-固綠染色 取每組大鼠膝關節脫鈣后做石蠟切片，切片脫蠟至水；鐵蘇木素液染核；流水沖洗；靜水放置；番紅 O 染液滴染 ；95% 乙醇分化；自來水洗；60 ℃ 預熱固綠滴染；蒸餾水急洗一次；番紅 O 染液復染 ；95% 乙醇分化；自來水洗。鏡下觀察關節軟骨的一般形態，并對膝關節軟骨進行Mankin’s 評分。膝關節軟骨Mankin’s 評分原則依據文獻[11]。

1.5 統計學處理 實驗數據采用SAS 8.2 軟件進行統計，結果用平均數±標準差（±s ）表示，多組間數據比較采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），2組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 祖師麻片對CIA模型大鼠AI評分的影響 見表1。

2.2 祖師麻片對CIA模型大鼠血清中生長因子、免疫因子及風濕因子的影響 見圖1。

2.3 祖師麻片對CIA模型大鼠血清中炎癥因子的影響 見圖2。

表1 祖師麻片對CIA大鼠AI評分的影響（±s ，n =12）

注：與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別 劑量/[mg/（kg·d）] 給藥前AI評分 給藥后AI評分2 d 4 d 6 d 8 d 10 d正常對照組 - 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0## 0.0±0.0##模型組 - 6.7±1.0 6.4±1.4 6.1±1.4 6.0±0.8 5.8±0.7 5.3±1.5雷公藤多苷片組 9 6.4±1.3 5.6±1.3 5.4±1.2 4.9±0.9# 4.3±0.8## 3.3±1.0##祖師麻片組3.96×102 6.1±1.8 5.9±1.7 5.6±1.5 5.3±1.3 5.1±1.2 4.5±0.9#7.92×102 5.9±1.6 5.7±1.9 5.3±1.0 5.2±1.3 4.6±1.1# 3.7±1.4##1.584×103 6.3±1.2 5.5±1.4 5.4±1.2 4.9±1.1# 3.9±1.0## 3.6±1.0##

圖1 祖師麻片對CIA模型大鼠血清中生長因子、免疫因子及風濕因子的影響

圖2 祖師麻片對CIA大鼠血清中炎癥因子的影響

2.4 膝關節軟骨番紅O-固綠染色 如圖3所示，各組大鼠膝關節番紅固綠染色比較，正常組大鼠膝關節軟骨結果光整如常，軟骨細胞數量正常，軟骨著色正常，潮線完整（圖3A）。模型組大鼠膝關節軟骨表面出現裂痕，軟骨細胞數量減少，染色重度減少，軟骨下骨血管入侵潮線（圖3B）。雷公藤多苷片組（圖3C）、祖師麻高（圖3D）、中（圖3E）、低（圖3F）劑量組軟骨細胞數量稍有減少，染色丟失較模型組少，潮線基本完整。

2.5 祖師麻片對CIA大鼠膝關節軟骨Mankin’s 評分比較 見圖4。

圖3 各組大鼠膝關節軟骨番紅O-固綠染色（× 400）

圖4 祖師麻片對CIA大鼠膝關節軟骨Mankin’s評分比較

3 討論

牛Ⅱ型膠原誘導的關節炎（collagen-induced anhritis，CIA）動物模型是研究類風濕性關節炎公認的模型，在國際上已廣泛應用于類風濕關節炎的基礎研究和抗類風濕關節炎特效藥物的研究[12]。目前，RA的臨床診斷標準主要依靠急性期反應物和血清中相關因子（如：CTGF、RF、IgG等）含量多少及癥狀持續的長短[13-14]。本研究結果顯示，與模型組相比，祖師麻片高劑量組能顯著的降低大鼠血清中結締組織生長因子、風濕因子、免疫球蛋白G含量，提示祖師麻片可能通過調節機體免疫對RA起治療作用。AI評分是衡量RA的又一標準參數[15]。本研究中，模型組大鼠前爪和后足紅腫、關節嚴重發炎，其AI評分與正常組比較顯著增加。環氧化物酶-2是花生四烯酸（arachidonic acid，AA）轉化為前列腺素的限速酶，是炎性細胞的前體的控制酶。非甾體抗炎藥物主要通過抑制COX-2的活性，從而阻斷AA的轉化，繼而降低PGE的大量生成，發揮抗炎作用[16]。IL-6是在感染和炎癥反應中顯著上調的細胞因子，在RA發病機制中起關鍵作用，導致滑膜細胞和關節周圍結構的破壞，此外，IL-6也參與B淋巴細胞的成熟、產生自身抗體等，造成患者關節的病變[17]。研究發現，TNF-α是RA發病機制中關鍵的致炎因子，誘導滑膜增生、軟骨/骨破壞和全身炎癥反應，且在RA發作后TNF-α水平顯示出“晝高、夜低”的24 h節律性變化[18]。本研究中，模型組大鼠血清中炎癥因子COX-2、IL-6、PGE-2、TNF-a含量顯著增加，膝關節軟骨表面出現裂痕，軟骨細胞數量減少，染色重度減少，軟骨下骨血管入侵潮線，Mankin’s評分顯著增加。祖師麻片不同劑量干預后，其AI評分及血清中COX-2、PGE-2、IL-6、TNF-α的含量顯著降低，可減輕CIA模型大鼠膝關節軟骨結構破壞的范圍和嚴重程度，并具有促進軟骨細胞增生的作用。祖師麻片不同劑量給藥組Mankin’s評分顯著降低也證實了其保護軟骨損傷的作用。

綜上所述，祖師麻片對Ⅱ 型膠原誘導的類風濕關節炎有顯著改善作用，在治療RA具有重要價值，其機制可能與抗炎、免疫調節作用有關。但其更深入的機制尚未完全清楚，因此，進而研究更深層次的機制具有重要的意義。